心肌尔康对柯萨奇Ｂ_（３ｍ）株的抑制作用龚蕴贞，林维芬，胡涛，黄升海，陈光亮提要用细胞病 变抑制试验研究心肌尔康抗柯萨奇Ｂ３ｍ的体外作用。发现心肌尔康作１０倍系列稀释试验时，对 １和１０ＴＣＩＤ５０病毒的５０％抑制（ＩＣ５０）剂量分别为１．３４×１０－２ｇ·Ｌ－１ 和１．５４ｇ·Ｌ－１，对１００和１０００ＴＣＩＤ５０病毒不能测出ＩＣ５０；该药在２倍系 列稀释时，对１０和１００ＴＣＩＤ５０病毒的ＩＣ５０分别为１．８１ｇ·Ｌ－１和２．５８· Ｌ－１，对１０００ＴＣＩＤ５０病毒仍无抑制，试验表明，心肌尔康在体外对柯萨奇Ｂ３ｍ病毒 有一定的抑制作用。主题词柯萨奇病毒Ｂ组／
药物作用；心肌炎／
中医药疗法；柯萨奇病毒感染／ 中医药疗法自由词心肌尔康中国图书分类号Ｒ３７３．２３；Ｒ２８７柯萨奇Ｂ组病毒是病毒性心 肌炎的最常见病原［１，２］，目前对心肌炎的治疗尚无理想的特效药物，安徽中医学院心肌尔康 课题组研制出治疗病毒性心肌炎的中药复方心肌尔康，Ⅰ期临床试用３１例，经１～１．５个月疗 程治疗，对病毒性心肌炎的有效率达８０．６４％，还能改善患者心电图的异常（待发表资料）。 为了探讨其治疗病毒性心肌炎的机理，我们首先进行心肌尔康体外抗病毒试验，结果表明，心肌尔 康对柯萨奇Ｂ_３ｍ株病毒致细胞病变有一定的抑制作用。１材料１．１病毒柯萨奇Ｂ组３型病毒 亲心肌株简称ＣＶＢ３ｍ，省医研所惠赠，－７０℃保存毒种。１．２细胞ＨｅＬａ传代细胞株。 １．３待测药物心肌尔康，由生晒参、麦冬、瓜篓、黄芪、苦参等组成的颗粒剂，每ｇ含生药２． ８２ｇ，用蒸馏水配制成２５０ｇ·Ｌ－１，含生药量７１０ｇ·Ｌ－１的水溶液，煮沸消毒，无 菌试验（－）后４℃放置备用。１．４阳性对照药三氮唑核苷注射液，上海禾丰制药有限公司生产 ，批号９４０９０３，原液１００ｇ·Ｌ－１。１．５实验设备４０孔微量细胞培养板（天津有机 玻璃厂制品），５％ＣＯ２培养箱（重庆试验设备厂），倒置显微镜（重庆光学仪器厂），－７０ ℃冰箱（日本三洋公司生产）。２方法２．１病毒感染力测定ＨｅＬａ细胞３×１０８·Ｌ－１， 每孔接种０．１ｍｌ，置３７℃５％培养箱培养，形成单层后滴定病毒。病毒ＣＶＢ３ｍ按１０倍 系列稀释，每一稀释度接种０．１ｍｌ，重复４孔，另设正常细胞对照４孔。每日观察ＣＰＥ，以 “＋～”记录结果，直至细胞病变不再增加，按Ｒｅｅｄ－ｍｕｅｎｃｈ法计算病毒半数感染量（ ＴＣＩＤ５０）［３］。２．２药物对ＨｅＬａ细胞的毒性测定以２５０ｇ·Ｌ－１心肌尔康作为 原液，按１０倍系列稀释，接种于形成单层的ＨｅＬａ细胞孔，每孔０．１ｍｌ，每一稀释度重复 ４孔，最后每孔补充营养液０．１ｍｌ；正常细胞对照以ＭＥＭ液替代药物。每天观察结果，计算 半数中毒浓度（ＴＤ５０）和最大无毒浓度（ＴＤ０）［４］。２．３心肌尔康体外抗ＣＶＢ３ｍ ：试验倾去形成单层的ＨｅＬａ细胞培养液，加入１、１０、１００、１０００、ＴＣＩＤ５０病 毒０．１ｍｌ，吸附１ｈ后用ＰＢＳ作者单位：安徽医科大学微生物教研室２３００３２安徽中医 学院药理教研室２３００３２洗涤２次，洗去游离病毒，选用最大无毒浓度ＴＤ０药液，按２倍和 １０倍稀释各５个浓度，每浓度４孔，分别加入已感染或未感染病毒的细胞孔内，３７℃ＣＯ２孵 箱中培养，每天观察结果，以细胞对照（一），病毒对照时为准，计算药物抑制百分率及药物的半 数有效量（ＩＣ５０）。２．４计算治疗指数，３结果３．１ＣＶＢ３ｍ株病毒的感染力（ＴＣＩ Ｄ）保存于－７０℃的毒株ＴＣＩＤ５０为１０－６，实验时将保存毒株传一代后，培养瓶速融冻 ３次，２０００ｒｐｍ３０ｍｉｎ去除细胞碎片，分装贮存于一７０℃，经滴定ＴＣＩＤ５０为１ ０－６．５。３．２心肌尔康对ＨｅＬａ细胞的半数中毒量ＴＤ５０和最大无毒量ＴＤ０１０倍系 列稀释时ＴＤ５０为５．４ｇ·Ｌ－１，ＴＤ０为２．５ｇ·Ｌ－１；２倍系列稀释时ＴＤ５０为 ３．９６ｇ·Ｌ－１，ＴＤ０为０．２５ｇ·Ｌ－１。阳性对照药三氮唑核苷注射液１０倍系列稀 释的ＴＤ５０为３．１ｇ·Ｌ－１，ＴＤ０为１ｇ·Ｌ－１；２倍系列稀释的ＴＤ０为２ｇ·Ｌ－ １。３．３药物抑制百分率及药物的半数有效量（ＩＣ５０）将心肌尔康和三氮唑核苷按１０倍系 列稀释，与不同ＴＣＩＤ５０的ＣＶＢ３ｍ进行抑病毒试验，计算病毒抑制百分率。以病毒抑制百 分率为纵坐标，药物浓度为横坐标作图，求出药物对不同浓度病毒的半数有效量ＩＣ５０，结果见 图１。从图１可见，心肌尔康１０－４．２７（相当于药物１．３４×１０－２ｇ·Ｌ－１）时， 对１个ＴＣＩＤ５０病毒有５０％抑制；１０－２．２１（相当于药物１．５４ｇ·Ｌ－１）时， 对１０个ＴＣＩＤ５０病毒有５０％抑制；但对于１００个ＴＣＩＤ５０病毒，当药物２．５ｇ· Ｌ－１时只有１２．５％的抑制，未能检出ＩＣ５０的药物浓度，对１０００ＴＣＩＤ５０的病毒 无抑制作用。阳性对照药三氮唑核苷，在１×１０－３～１ｇ·Ｌ－１浓度范围内，随药物浓度增 高其抑制病毒作用增强，在１０－４．５７（２．７×１０－３ｇ·Ｌ－１），１０－４０８７（ １．４×１０－３ｇ·Ｌ－１），１０－３．５３（２．９×１０－２ｇ·Ｌ－１），１０－３． ３３（４．７×１０－２ｇ·Ｌ－１）时，分别对１、１０、１００、１０００个ＴＣＩＤ５０病 毒有５０％抑制。心肌尔康浓度（ｇ·Ｌ－１）三氮唑核苷浓度（ｇ·Ｌ－１）图１药物剂量与病 毒抑制率的关系为了更精确测出心肌尔康的ＩＣ５０，药物２倍系列稀释，分别做１０、１００个 ＴＣＩＤ５０病毒抑制试验，结果见图２。从图２可见心肌尔康对１０ＴＣＩＤ５０病毒的ＩＣ５ ０为１０－２．１４（１．８１ｇ·Ｌ－１），１００ＴＣＩＤ５０病毒为１０－２（２．５ｇ· Ｌ－１）；而阳性对照药的ＩＣ５０，对１０、１００ＴＣＩＤ５０病毒分别为１０－２．１４（ ０．７２ｇ·Ｌ－１）和１０－２．６（＜０．２５ｇ·Ｌ－１）。３．４治疗指数（ＴＩ值）经 计算心肌尔康的ＴＩ值在１．８～２．２～２６０之间，三氮唑核苷的ＴＩ值在１．７５～１２． ４～１１４８范围内，表明心肌尔康的安全范围小于三氮唑核苷。４讨论体外抗病毒药效试验，可 根据不同病毒选择细胞病变、细胞活性染色、病毒核酸、病毒抗原、病毒繁殖量等不同的指标表示 ［４］，ＣＶＢ３ｍ对ＨｅＬａ细胞的病变作用明显，病变规则而易在显微镜下观察，我们参照苦 参粗提液体外抗ＣＶＢ组病毒作用的方法［６］，观察抗细胞病变作用，但有不同，苦参经不同稀 释后与１００ＴＣＩＤ５０病毒直接作用１ｈ后再定量加入ＨｅＬａ细胞，于７２ｈ观察结果；本 试验为待ＨｅＬａ细胞形成单层后加入不同ＴＣＩＤ５０病毒，经吸附１ｈ和ＰＢＳ洗涤二次后再 加入不同浓度的药物，以避免药物对细胞外病毒的直接作用。此外，我们发现不同浓度的病毒，在 ＨｅＬａ细胞上均于４８ｈ达１００％病变，因此以４８ｈ结果计算ＩＣ５０，可缩短观察时间， 每次试验设立阳性药物－三氮唑核苷作对照试验，该药对多种ＲＮＡ和ＤＮＡ病毒有抑制作用，能 阻止病毒的复制，但无直接灭活作用［５］。本试验中三氮唑核苷浓度在１×１０－３～１ｇ·Ｌ －１范围内，随药物浓度增加抗病毒作用增强，对病毒的四个浓度反应一致，且能重复。心肌尔康 在１０倍系列稀释试验中，对１和１０ＴＣＩＤ５０病毒的抑制作用随药物浓度增加而加强，ＩＣ ５０分别为１．３４×１０－２ｇ·Ｌ－１和１．５４ｇ·Ｌ－１，但对１００、１０００ＴＣＩ Ｄ５０病毒不能测出ＩＣ５０。心肌尔康在２倍系列稀释时，对１０、１００ＴＣＩＤ５０病毒有
抑制作用，ＩＣ５０分别在１．８１～２．５ｇ·Ｌ－１，对１０００ＴＣＩＤ５０病毒仍无５０ ％抑制。心肌尔康体外试验的治疗指数（ＴＩ）范围在１．８７～２．２～２６０之间，与三氮唑 核苷相比安全范围较小，我们将心肌尔康置于４℃３．５个月后，再次按同法试验，结果发现药物 对ＨｅＬａ细胞的毒性作用下降，最大无毒量为２５图２药物剂量与病毒抑制率的关系ｇ·Ｌ－１ ，对１０、１００、１０００ＴＣＩＤ５０病毒的ＩＣ５０分别为８．１×１０－２ｇ·Ｌ－１、 １．９３ｇ·Ｌ－１和２．５ｇ·Ｌ－１，但其抗病毒作用仍与以前一样，因而使治疗指数增大， ＴＩ值分别为１０、１２．９和３１０，安全范围亦变大，是否与复方制剂中含有的挥发性物质丧 失或（和）毒性成分破坏等有关；以及可能还有其他抗病毒机理，有待进一步研究。（本研究过程 中得到张咏南教授、王钦茂教授的指导，特此感谢。）参考文献｜｜１ＷｏｏｄｒｕｆｆＪＦ。Ａ ｍＪｐａｔｈｏｌ．１９８０；１０１（２）：４２７～４７９２杨应珍编，病毒性心肌炎，上海 ：上海医科大学出版社，１９９１３中国医学科学院流行病防治研究所编。常见病毒病实验技术， 北京：科学出版社，１９７８：３５４中华人民共和国卫生部药政局。新药（西药）临床前研究指 导原则汇编。抗病毒药物药效指导原则，１９９３；７：１６３～１７９５ 杨藻宸，褚云鸿，束 怀德等。医用药理学，第２版，北京：人民卫生出版社，１９８２：６８～８０７６刘晶星，陈曙 霞，陆德源等，上海第二医科大学学报，１９９１，１１（２）：１４０～１４２Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆＸｉｎｊｉｅｒｋａｎｇａｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｃｏｘｓａｃｋｉｅＢ_（３ｍ）ｖｉ ｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ￥ＧｏｎｇＹｕｎｚｈｅｎ；ＬｉｎＷｅｉｆｅｎ；Ｈ ｕＴａｏ；ｅｔａｌＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｘｉｎ－ｊｉ－ｅｒ－ｋａｎｇｉｓａｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂｓｐｒｏｖｅｄｔｏｈａｖｅｃｅｒｔａｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｎｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ．Ｉｔｉｓｏｂｓｅｒｖｅｄｔｏｈａｖｅａｎｔｉ－ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＢ_３ｍｅｆｆｅｃｔｓｉｎＨｅＬａｃｅｌｌｌｉｎｅｂｙｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ－ｔｅｓｔ．ＩｔｓＩＣ_５０ｔｏ１ａｎｄＴＣＩＤ_５０
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