人卵巢癌细胞阿霉素耐药株的建立及其耐药机制的探讨李佩茵，林晨（中国医学科学院肿瘤研究所， 北京１０００２１）摘要人卵巢癌阿霉素耐药细胞株是用Ａ２７８０人卵巢癌细胞株作亲本，获得 的能耐受０．８μｇ．ｍｌ－１ＡＤＭ的细胞株Ａ２７８０／ＡＤＭ。此细胞株对ＡＤＭ的耐受程 度约为Ａ２７８０细胞的１７倍。对其他抗肿瘤药如长春新碱、鬼臼乙叉甙有明显的交叉耐药，对 ５－氟脲嘧啶、顺铂、米尔法兰则无明显交叉耐药性。进一步研究表明耐药株对ＡＤＭ蓄积明显减 少；免疫细胞化学的研究显示：Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞中Ｐ－１７０膜蛋白和谷胱甘肽Ｓ－转移 酶（ＧｓＴ－π）均较Ａ２７８０表达高。对耐药的逆转也进行了初步研究，发现维拉帕米与ＡＤ Ｍ合用能提高Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞对ＡＤＭ的药物敏感性，细胞的耐受性得到部分逆转。关键 词人卵巢癌阿霉素耐药细胞株，
多药耐药，倍增时间，Ｐ－糖蛋白耐药是肿瘤化疗成功的重大障碍 ，某些肿瘤具有固有耐药性特点，另一些肿瘤则在化疗后产生获得性耐药。
阿霉素（ａｄｒｉａｍ ｙｃｉｎ，ＡＤＭ）是一种有效的蒽环类抗癌抗生素，被广泛用于包括卵巢癌在内的多种肿瘤的治 疗。肿瘤细胞对多种药物产生耐药的原因相当复杂。体外培养的耐药细胞珠对肿瘤耐药机制的研究 是国内外一活跃内容。本文通过耐药细胞株Ａ２７８０／ＡＤＭ的建立，初步探讨了其耐药机制， 并对耐药的逆转进行了研究，目的在于用此模型进一步寻找能逆转耐药的化合物以提高肿瘤化疗的 疗效。材料细胞Ａ２７８０（人卵巢癌细胞株，由中国医学科学院药物研究所赠送，药物所引自美 国）。药品阿霉素（ＡＤＭ）为意大利Ｆａｒｍｉｔｕｌｉａ产品；顺铂（ＤＤＰ）：山东齐鲁制 药厂、５－氟脲嘧啶（５－ＦＵ）：上海海普制药厂；长春新碱（ＶＣＲ）：北京医科大学实验药 厂；鬼臼乙叉甙（ＶＰ－１６）：北京医药工业研究所；米尔法兰（ｍｅｌｐｈａｌａｎ，Ｍｅｌ ）：Ｓｉｇｍａ产品；维拉帕米（Ｖｅｒ）：辽宁锦州制药二厂。试剂单克隆抗体ＪＳＢ－Ｉ，识 别ｍｄｒ－１产物ｐ－１７０膜蛋白，由荷兰ＲＪＳｃｈｅｐｅｒ教授惠赠ＧＳＴ－π由军事医学 科学院提供；ＡＢＣ试剂盒系Ｖｅｃｔｏｒ产品。方法和结果耐药细胞株的建立选用接种４８ｈ后 处于指数生长期的Ａ２７８０细胞，用浓度为１０ｎｇ·ｍ１－１的ＡＤＭ反复处理。待生长稳定 后，逐步增加ＡＤＭ的浓度，开始时２～３周增加一倍的剂量，以后逐渐递增ＡＤＭ的浓度，共培 养１０个月。约传代５０次后，得到一耐受ＡＤＭ浓度为０．８μｇ·ｍｌ－１的生长良好的耐药
细胞株，命名为人２７８０／ＡＤＭ。该细胞株已反复传代３个月。Ａ２７８０／ＡＤＭ生物学特 性细胞株稳定性细胞在不含ＡＤＭ的培养液中培养，随着时间的延长，其耐受性会逐渐降低［１］ （见表ｌ）。群体倍增时间（ＴＤ）的测定［２］每瓶接种细胞为４Ｘｌ０４个，接种后１～７ｄ ，每天取２瓶计细胞总数，在半对数座标纸上绘制生长曲线，按Ｐａｔｌｅｒｓｏｎ氏公式计算细 胞在指数生长期的ＴＤ。结果表明，Ａ２７８０和Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞的倍增时间分别为２６ ．３ｈ和４７．８ｈ，耐药细胞的生长速度显然比敏感细胞缓慢。集落形成率选用指数生长期细胞 制成单细胞悬液，接种在３５ｍｍ平皿中，置于３７Ｃ５％ｃｏ２温箱，Ａ２７８０培养１０ｄ， Ａ２７８０／ＡＤＭ培养１８ｄ。培养结束，用甲醇固定结晶紫染色，计集落总数。结果Ａ２７８ ０／ＡＤＭ集落形成率为１５～２０％，Ａ２７８０集落形成率为６５～７５％。药物敏感性实验 按Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ和Ｓａｌｍｏｎ［３，４］报道的集落形成法测定，癌细胞接种１６ｈ后， 加入药物，各种药设５～６个剂量组，每组３个平皿。药物处理２４ｈ后，除去药物，用生理盐水 洗涤，以中止药物的作用。换新鲜１６４０培养液后继续培养１０～１８ｄ，计集落形成率。以给 药组的集落形成率与对照组集落形成率之比的百分数，计算每种药物浓度的细胞存活率。以存活率 为纵座标，药物浓度为横座标，在半对数座标纸上作剂量一存活率曲线，并求出半数抑制剂量ＩＣ ５０。由图１可看到ＡＤＭ对Ａ２７８０细胞作用的ＩＣ５０为０．０ｌ３μｇ·ｍｌ－１，而Ａ ２７８０／ＡｏＭ则为０．２２２μｇ·ｍ１－１，即该耐药细胞对ＡＤＭ的耐受能力为敏感株的 １７倍（见图ｌ）。交叉耐药实验结果表明，耐ＡＤＭ细胞株Ａ２７８０／ＡＤＭ对其他几种作用 机理不同的抗肿癌药也有不同程度的交叉耐药性（见表Ｉ）。Ａ２７８０／ＡＤＭ对氏春新碱（Ｖ ＣＲ）和鬼臼乙叉甙（ＶＰ－１６）的耐药程度分别是Ａ２７８０的８．１倍和５．５倍；但Ａ２ ７８０／ＡＤＭ对５－氟脲嘧啶（５－Ｆｕ）、米尔法兰（Ｍｅｌ）和顺铂（ＰＤＤ）并无明显的
交叉耐药性。细胞内阿霉素聚积量［５．６］取指数生长期细胞接种４８ｈ后，分别加入２，４， ８，１２，１６μｇ·ｍｌ－１ＡＤＭ，每一剂量３瓶。１．５ｈ后用冰冷ＰＢＳ洗涤，收集细胞 并计数；在细胞中加入１：ｌ混合的０．３ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣＩ和５０％乙醇，一２０Ｃ过夜， 提取细胞内ＡＤＭ。次日置于４℃１２０００ｒ·ｍｉｎ－１，离心３０ｍｉｎ收集上清液。在Ｒ Ｆ－５１０荧光分光光度计上测ＡＤＭ的荧光强度（激发波长和发射波长分别为４７０ｎｍ和５４ ８ｎｍ）。由图２可见，两种细胞内ＡＤＭ的聚集量均随细胞外药物浓度的升高而增加。耐药细胞 内ＡＤＭ的量低于亲代细胞，统计学有显著差别（Ｐ＜０．０５）（见图２）。耐药机理用免疫细 胞化学测定蛋白产物Ｐ－ｌ７０和ＧＳＴ－π［７］。将细胞接种在载玻片上，２４ｈ后取出，再 用ＰＢＳ冲洗。冷丙酮固定１５ｍｉｎ，用ＰＢＳ冲洗，１％马血清封闭３０ｍｉｎ，甩片，加一 抗（抗ｍｄｒ－１单抗，ＪＳＢ）室温作用１ｈ后，用ＰＢＳ冲洗，加二抗（马抗鼠抗体）３７Ｃ １ｈ，洗片；加ＡＢＣ（卵白素一生物素一酶复合物法）反应复合物，３７℃０．５ｈ用ＰＢＳ冲 洗后加ＤＡＢ（３，３二氨基联苯胺显色。当一抗为ＪＳＢ－１时，Ａ２７８０为阴性，Ａ２７８ ０／ＡＤＭ为弱阳性。表示细胞经ＡＤＭ诱导耐药后，有ｍｄｒ－１基因产物Ｐ－ｌ７０的表达。 用ＧＳＴ－π作为一抗时的免疫细胞化学的结果显示Ａ２７８０为弱阳性，Ａ２７８０／ＡＤＭ为 阳性，表明耐药细胞的胞内谷胱甘肽Ｓ－转移酶有所增多。耐药的逆转维拉帕米（Ｖｅｒ）对ＡＤ Ｍ在Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞毒作用的影响：用集落形成法测定，ＡＤＭ对Ａ２７８０／ＡＤＭ作 用２４ｈ后的ＩＣ５０为０．２２２μ·ｍｌ－１，ＡＤＭ和Ｖｅｒ联合作用２４ｈ后，可使ＡＤ Ｍ对该耐药株的药物敏感性增强，使其ＩＣ５０降到０．０２６μｇ·ｍｌ－１，即ＡＤＭ的细胞 毒性增加７．５倍。结果表明，上述浓度的Ｖｅｒ可以明显地逆转Ａ２７８０／ＡＤＭ对ＡＤＭ的 耐药性，但并没有达到完全逆转的效果（图３）。讨论在有关抗癌药物耐药性的文献中，报道典型 的多药耐药ＭＤＲ和Ｐ－糖蛋白有关，涉及的药物包括蒽环类、长春碱类、表鬼臼毒素类、秋水仙 素和放射菌素等疏水性天然性产物．而烷化剂和抗代谢类药物则不产生ＭＤＲ。从本文两种细胞株 对不同抗癌药物的敏感性的分析表中叶看出，Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞对ＶＰ－１６及ＶＣＲ有明 显的交叉耐药作用，对ＰＤＤ和Ｍｅｌ有伴随敏感性，说明此耐药细胞是由Ｐ－糖蛋白参与的典型 ＭＤＲ。Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ的聚集量较亲代细胞降低，可能与细胞膜的Ｐ－糖蛋白 过量表达，将药物泵出细胞外有关［８，９］。Ｖｅｒ是一种钙通道阻滞剂，可通过竞争抗癌药物 Ｐ－糖蛋白的结合位点来达到抑制Ｐ－糖蛋白将药物泵出的功能［１０，１１］。本研究表明Ｖｅ ｒ和ＡＤＭ合用可以增加Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞对ＡＤＭ的敏感性而逆转耐药，也同样证明了这 一点。使用抗Ｐ－１７０单抗ＪＳＢ－１对Ａ２７８０／ＡＤＭ和Ａ２７８０的细胞内ｐ－糖蛋白 进行免疫组化，发现Ａ２７８０／ＡＤＭ呈阳性，证实Ａ２７８０／ＡＤＭ耐药细胞中含有Ｐ－糖 蛋白。此外，用抗谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ－π）单抗进行的免疫组化实验显示Ａ２７８０／ ＡＤＭ细胞中ＧＳＴ－ｌπ的表达超过Ａ２７８０细胞，说明Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞的耐药除了 Ｐ－糖蛋白参与之外，还有其他机制，谷胱甘肽解毒途径有关的酶表达增多，可能也是一个重要原 因，有待进一步研究。参考文献｜｜１ＴｓｕｒｕｏＴ、Ｌｉｄａ一ＳａｉｔｏＨ，Ｋａｗａｂａ ｔａＨｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｄｒｉａｍ ｖｃｉｎｉｎｈｕｍａｎｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓｌｅｕｋｅｍｉａＫ５６２ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏａｄｒｉａｍｙｃｉｎａｎｄｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｃｌｏｎｅｓ．ＪｐｎＪＣａｎｃｅｒＲ ｅｓ（Ｇａｎｎ），１９８６，７７：６８２２ＪａｋｏｂｙＷＢ。ＭｅｆｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ，ＶｏｌＬＶＩＩｌ．Ｌｏｎｄｏｎ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓｌｎｃ，１９７ ９：１５０３ＨａｍｂｕｒｇｅｒＡＷ，ＳａｌｍｏｎＳＥ。Ｐｒｉｍａｒｙｂｉｏａｓｓａｙｏ ｆｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７７．１９７：４６１４李 学汤，林晨，李佩茵等。七种人癌细胞系对冬凌草甲素的敏感性比较．药学学报，１９８５，２０ ：２４３５ＨｅＱＹ。Ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｂｙ ｔｃｔｒａｎｄｒｉｎｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｌｉｎｅ。Ａｃ ｔａＰｈａｒｍａｃｏｌ，１９９２．１３：４１６６Ｚｉｊｌｓｔｒａ，ＪＧ，ＶｒｉｅｓＥＧ Ｅ．ＭｕｌｄｅｒＮＨ。ＭｕＩｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎａｎａｄｒｉａｌｎｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｈｕｍａｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９８７，４７：１７８０７杨景山主编。医学细胞化学与细胞生物技术。北京：中国协和医科大学联合出版社，１９９０：１０５～１１
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