人参茶多酚等在体外抗含氧自由基的分析福建省中医药研究院（福州３５０００３）林一萍，吴瑞荣 摘要根据Ｆｅｎｔｏｎ及Ｈａｂｅｒ─Ｗｅｉｓｓ反应，以脱氧核糖作为羟自由基分子探针，检测 脱氧核糖降解物与硫代巴比妥酸显色反应，对照分析超氧歧化酶（ＳＯＤ）、硫脲、
茶多酚、人参 对含氧自由基的清除作用，证明茶多酚只能抑制氧化物阴离子自由基（Ｏ），作用与ＳＯＤ相近。 人参不仅能抑制羟自由基（ＯＨ·），也能抑制氧自由基（Ｏ），作用与硫脲相近。主题词人参／
药理学，多酚／药理学，茶／药理学，自由基去除剂中图分类号Ｒ２８５．５自由基的检测方法很 多，如电子顺磁共振法，气一液相色谱法，发光法等，但大多数须要昂贵的仪器，操作也复杂，一 般实验室难以应用，我们根据Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ［１］等人设计的以脱氧核糖作为羟自由基分子 探针的反应系统，检则脱氧核糖降解物与硫代巴比妥酸显色反应，对照分析了超氧歧化酶（ＳＯＤ ）、硫脲、茶多酚、人参对含氧自由基的清除作用。此法简易、快速，适宜大量样品比较分析，可 作为筛选含氧自由基清除剂的有用指标。１材料和方法１．１２－脱氧－Ｄ－核糖（瑞士进口）， １．１．３．３－四甲氧基丙烷（日本进口），ＳＯＤ、黄嘌呤氧化酶、次黄嘌呤（上海东风生化 试剂厂）。其余试剂均为国产分析纯。１．２人参由福建省药材站购进的野参（３ｇ级），茶多酚 为提取的总茶多酚。１．３分析羟自由基反应系统：在２ｍｌ的反应液中有２－脱氧－Ｄ－核糖（ ３０ｍｍｏｌ／Ｌ）１７０μ１；ＥＤＴＡ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）４０μｌ；ＦｅＳＯ４（２ｍｍｏ ｌ／Ｌ）４０μｌ；次黄嘌呤（２ｍｍｏｌ／Ｌ）２００μｌ；磷酸缓冲液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ ，ｐＨ７．４）１．５ｍｌ；Ｈ２Ｏ２（１７．６ｍｍｏｌ／Ｌ）１０μｌ；反应开始加入黄嘌呤 氧化酶（０．４ｕ／ｍｌ）４０μｌ。反应混合液在３５℃培养１５ｍｉｎ。１．４分析氧自由基 反应系统：用０．１５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４的磷酸缓冲液代替上述羟自由基系统中的ＦｅＳＯ４ 和Ｈ２Ｏ２。１．５硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）
显色反应：取上述培养液１ｍｌ加入ＴＢＡ（１％ｗ ／ｖ；在０．０５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ）１ｍｌ和冰醋酸１ｍｌ，混匀后在沸水浴中加热３０ｍｉ ｎ，冷却后于７２３分光光度计上测Ａ５３２ｎｍ，以１．１．３．３─四甲氧基丙烷作标准液， 每种样品重复测定６份。２实验结果几种清除剂对氧自由基（Ｏ）和羟自由基（ＯＨ·）的抑制作 用见附表。附表人参等对含氧自由基的抑制作用３讨论３．１Ｈ２Ｏ２可被某些变价金属离子（Ｆ ｅ２＋）或含氧自由基（Ｏ）还原产生ＯＨ·，这是两个最常见的可以产生ＯＨ·的反应即Ｆｅｎ ｔｏｎ反应和Ｈａｂｅｒ－Ｗｅｉｓｓ反应；而黄嘌呤氧化酶可以催化次黄嘌呤氧化生成尿酸，同 时还原氧分子成Ｏ，这些反应生成的含氧自由基可以使２－脱氧－Ｄ－核糖降解，其产物与硫代巴 比妥酸（ＴＢＡ）起显色反应，在Ａ５３２ｎｍ处有显著的吸收。已证实Ｏ、Ｆｅ＋＋和抗坏血酸 能驱动Ｆｅｎｔｏｎ反应，使之增加系统中的ＯＨ·，本试验以黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤反应生成 的Ｏ作为Ｆｅｎｔｏｎ反应的驱动。根据Ｃｅｄｅｒｂａｕｍ等人报道［２］，二甲亚讽、异丙醇 、苯甲酸、乙醇、甘露醇和硫脲都是羟自由基的清除剂，本试验也证明了硫脲不仅能有效地抑制羟 自由基系统内脱氧核糖降解及产生的ＴＢＡ反应（抑制率达５２％，见附表）同时还能抑制Ｏ反应 系统中含氧自由基降解脱氧核糖及产生的ＴＢＡ反应，也就是说硫脲对ＯＨ·和Ｏ均有清除作用。 ＳＯＤ是已知的Ｏ清除剂，它能促使Ｏ变为过氧化氢和氧分子，从而达到清除Ｏ。本实验中的ＯＨ ·反应系统和Ｏ反应系统均能被ＳＯＤ抑制且清除率均为３３％，因为ＯＨ·反应系统中以Ｏ作为 驱动Ｆｅｎｔｏｎ反应的因子，由此证明ＳＯＤ只抑制Ｏ。王成莲［３］等人证明，在铜离子（Ｃ ｕ＋＋）存在下，依赖于抗坏血酸的ＯＨ·形成不受ＳＯＤ的抑制。因为该体系中未见同时产生Ｏ 的迹象，这和我们的实验观察是一致的。茶叶已被证明能有效地抗脂质过氧化作用，有延缓衰老的 作用［４］，且有效成份是茶多酚，它是否也能清除含氧自由基，我们采用总茶多酚作为反应的清 除剂，其结果与ＳＯＤ相似，它只能抑制Ｏ，（两个反应系统的清除率均为１６％）。人参的主要 功用为大补元气，调补五脏，延缓衰老，是中医中药重要的抗衰老药物，在本实验条件下，它不仅 可以抑制ＯＨ·反应系统，也能抑制Ｏ反应系统，而对ＯＨ·的清除率比Ｏ大，其作用与硫脲相似 ，但这个浓度的作用不及硫脲。在生物体内，任何参与自由基反应而又不给细胞造成损害，都可用 作自由基清除剂，使之形成比原来的自由基具有较小毒性的产物，从而对细胞起保护作用。上述方 法可以简单、快速地检测一种物质对自由基的抑制作用，对筛选含氧自由基清除剂提供有用的信息 。３．２利用硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）测定丙二醛（ＭＤＡ）是一仲常用的检测脂质过氧化物的方 法［５］，但本实验中，在ＯＨ·和Ｏ作用下，脱氧核糖的降解物与ＴＢＡ同样可以产生ＭＤＡ─ ＴＢＡ反应，我们用１．１．３．３－四甲氧基丙烷作标准物。其吸光度Ａ５３２ｎｍ＝０．５４ ０，这一结果表明，脱氧核糖在含氧自由基的作用下，其降解物可能是含有ＭＤＡ或ＭＤＡ的类似 物，因此ＭＤＡ─ＴＢＡ还适宜于作为生物材料产生氧自由基的指标。参考文献｜｜１Ｈａｌｌｉ ｗｅｌｌＢ，ＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅＪＭＣ．Ｉｎ：ＧｒｅｅｎｗａｌｄＲＡｅｄ，Ｈａｎｄｂｏ ｏｋｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＢｏｃａＲａｔ ｏｎＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９８５，１７７～１８０２ＣｅｄｅｒｂａｕｍＡＩ．ＣｏｈｅｎＧ． Ｉｎ：ＧｒｅｅｎｗａｌｄＲＡｅｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＢｏｃａＲａｔｏｎＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９８５，８１～８ ７３王成莲，等．比色法测定抗坏血酸体系产生的ＯＨ·自由基．生物化学与生物物理进展，１９ ８９，（６）：４７３４林一萍，等．茉莉花茶的抗脂质过氧化作用及对果蝇寿命的影响．福建茶 叶，１９８６；（４）：２６５莫简，等．医用自由基生物学导论．北京：人民卫生出版社．１９ ８９．３５ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＧｉｎｓｅｎｇ＆Ｔｅａ－ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｆｏｒＳｃａ ｖｅｎｇｉｎｇＡｃｔｉｏｎｏｆＯｘｙｇｅｎｉｃＦｒｅｅＲｅｄｉｃａｌｉｎＶｉｔｒｏ￥Ｌ ｉｎＹｉｐｉｎｇ；ＷｕＲｕｉｒｏｎｇ（ＦｕｊｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴＣＭ＆Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌｏｇｙ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｏｆＦｅｎｔ ｏｎａｎｄＨａｂｅｒ－Ｗｅｉｓｓ，ｕｓｉｎｇｔｈｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅａｓａｐｒｏｂ ｅｏｆｈｙｄｒｏｘｙｒａｄｉｃａｌｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐｒｏ ｄｕｃｔｏｆｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅｂｙｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃａｃｉｄｒａｃｔｉｏ ｎｗａｓｔｅｓｔｅｄ，ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅａｃｔｉｏｎａｎｄｐｏｔｅｎｃｙｏｆ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌｓｐｅｃｉｅｓｗｉｔｈｓｕｐｅｒｏｘｉｄ ｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ），ｔｈｉｏｕｒｅａ，ｔｅａ－ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌａｎｄｇ ｉｎｓｅｎｇ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｅａ－ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｃｏ ｕｌｄｏｎｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｏ ）ｗｈｉｃｈｔｈｅｅｆｆｅｃｔｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆＳＯＤ．Ｈｏｗｅｖｅ ｒｇｉｎｓｅｎｇｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｎｏｔｏｎｌｙｈｙｄｒｏｘｙｒａｄｉｃａｌ（Ｏ Ｈ）ｂｕｔａｌｓｏＯｗｈｉｃｈｔｈｅｅｆｆｅｃｔｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆｔ ｈｉｏｕｒｅａＫｅｙｗｏｒｄｓ：Ｇｉｎｓｅｎｇ／ｐｈａｒｍ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ／ｐｈ ａｒｍ；Ｔｅａ／ｐｈａｒｍ；ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｅｒ人参茶多酚等在体外 抗含氧自由基的分析@林一萍，吴瑞荣$福建省中医药研究院人参／药理学，多酚／药理学，茶／ 药理学，自由基去除剂根据Ｆｅｎｔｏｎ及Ｈａｂｅｒ─Ｗｅｉｓｓ反应，以脱氧核糖作为羟自由 基分子探针，检测脱氧核糖降解物与硫代巴比妥酸显色反应，对照分析超氧歧化酶（ＳＯＤ）、硫 脲、茶多酚、人参对含氧自由基的清除作用，证明茶多酚只能抑制氧化物阴离子自由基（Ｏ），作 用与ＳＯＤ相近。人参不仅能抑制羟自由基（ＯＨ·），也能抑制氧自由基（Ｏ），作用与硫脲相 近。１ＨａｌｌｉｗｅｌｌＢ，ＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅＪＭＣ．Ｉｎ：ＧｒｅｅｎｗａｌｄＲＡｅ ｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ ．ＢｏｃａＲａｔｏｎＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９８５，１７７～１８０２ＣｅｄｅｒｂａｕｍＡＩ ．ＣｏｈｅｎＧ．Ｉｎ：ＧｒｅｅｎｗａｌｄＲＡｅｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆ ｏｒｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＢｏｃａＲａｔｏｎＣＲＣＰｒｅｓｓ，１ ９８５，８１～８７３王成莲，等．比色法测定抗坏血酸体系产生的ＯＨ·自由基．生物化学与生 物物理进展，１９８９，（６）：４７３４林一萍，等．茉莉花茶的抗脂质过氧化作用及对果蝇寿 命的影响．福建茶叶，１９８６；（４）：２６５莫简，等．医用自由基生物学导论．北京：人民 卫生出版社．１９８９．３５脱氧核糖的降解物与ＴＢＡ同样可以产生ＭＤＡ─ＴＢＡ反应，我们 用１．１．３．３－四甲氧基丙烷作标准物。其吸光度Ａ５３２ｎｍ＝０．５４０，这一结果表明，脱氧核糖在含氧自由基的作用下，其降解物可能是含有ＭＤＡ或ＭＤＡ的类似物，因此ＭＤＡ─ＴＢＡ还适宜于作为生物材料产生氧自由基的指标。参考文献｜｜１ＨａｌｌｉｗｅｌｌＢ，ＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅＪＭＣ．Ｉｎ：ＧｒｅｅｎｗａｌｄＲＡｅｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｍｅｔｈ
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