谷氨酸单钠对成年小鼠的神经毒性作用高静，吴娟，林凌，柳，赵晓宁，张祖暄（南京大学医学院神 经生理教研室，南京２１０００８）摘要［３Ｈ］谷氨酸（Ｃｌｕ）ｓｃ后的不同时程，柱层析分 离血清中［３Ｈ］Ｇｌｕ，液闪测定，发现随代谢时程的延长［３Ｈ］Ｇｌｕ的量明显降低。外周 组织中［３Ｈ］Ｇｌｕ含量的变化与血清中的类似，而神经组织则不同。非标记谷氨酸单钠ｓｃ以 剂量依赖方式损伤成年小鼠的分辨学习能力。引起特征性神经元退变，降低下丘脑和脊髓的线粒体 膜结合钙水平。结果表明，４．０ｍｇ·ｇ－１谷氨酸单钠可以透过血脑屏障对成年动物产生神经 毒性作用。其作用机理可能与细胞内Ｃａ２＋超载，线粒体封存或排空Ｃａ２＋的能力失常。最终 导致神经元损伤甚至死亡有关。关键词谷氨酸钠；血脑屏障；毒性；行为；下丘脑：线粒体：钙谷 氨酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ，Ｇｌｕ）是人和哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸，参与 中枢神经系统的信息传递，但过量的Ｇｌｕ对神经元有明显的损伤作用［１］，因此已被认为是内 源性兴奋性毒素［２］．现已公认兴奋性毒素的神经奏性作用与某些神经疾病，如脑缺氧／缺血性 损伤，阿耳茨海默氏症，肌萎缩侧索硬化症等有关［３］．但是由于Ｇｌｕ是带电荷的极性氨基酸 ，故对其能否透过成年哺乳动物血脑屏障产生神经毒性作用仍有争议［４，５］，其钠盐（谷氨酸 单钠，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｇｌｕｔａｍａｔｅ，ＭＳＧ）目前仍广泛用于食品工业或治疗某些 疾病（如肝昏迷）本文将同位素示踪，学习记忆行为试验，组织形态学观察及线粒体膜结合钙测定 等方法相结合，探讨成年哺乳动物血脑屏障对ＭＳＧ的通透性，观察ＭＳＧ的神经毒性作用并分析 其可能的神经化学机理．材料和方法药品及试剂ＤＬ－［２３－３Ｈ］Ｇｌｕ，中国上海原子核研 究所生产，放射性活度为７７７ＴＢｑ·ｍｏｌ１；非标记ＭＳＧ针剂，上海海普制药厂生产，浓 度２．８７５ｇ·Ｌ－１；Ｔｂ４Ｏ７，英国ＪｏｈｎｓｏｎＭａｔｔｈｅｙＭａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ生产；ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和焦油紫为进口分装：其余试剂均为国产分 析纯．同位素示踪昆明品系成年小鼠１８只，♀♂各半，３０．０±ｓ２．０ｇ，分别ｓｃ含［３ Ｈ］Ｇｌｕ（６４０ｋＢｑ）的ＭＳＧ（２．５ｍｇ·ｇ）－１）给药后１０，３０，６０ｍｉｎ 分３批眼眶放血，生理盐水心脏灌流。血液经１０００ｘｇ离心５ｍｉｎ，取血清，在Ｓｅｐｈａ ｄｅｘＧ－５０上，ＮａＣｌ０．１５ｍｏｌ·Ｌ－１洗脱层析，自动部分收集器收集，每管２． ０ｍＬ，收集第１１至４０管。放血后，分别分离小鼠的前脑，小脑，脊髓，肝，肾等组织，洗涤 ，称重，８０℃水浴消化（消化液为４０％ＨＣＯＯＨ：３０％Ｈ２０２，１：１）ｋｈ．分别取 ０．２ｍＬ血清层析液及组织消化液，移入闪烁瓶，加入２．５ｍＬＴｒｉｔｏｎＸ－１００甲苯 闪烁液，摇匀，过夜，用ＢｅｃｋｍａｎＬＳ－９８００型液闪仪测定放射性强度。放射性测定数 据按Ｐｏｉｓｓｏｎ分布处理，以ｃｐｍ／１００ｍｇ组织为单位。实验动物与给药方式昆明品系 成年小鼠１５０只，体重３０．０±ｓ１０ｇ，♀♂各半，均随机分为对照组（ｓｃ生理盐水， 每３０ｇ体重０，２ｍＬ）和实验组．实验组分别ｓｃ４．０或２．５ｍｇ·ｇ－１ＭＳＧ，２４ ｈ后进行下列实验。行为实验给药后２４ｈ，对不同处理组的３６只小鼠进行Ｙ－迷宫行为训练［ ６］．迷宫的底部为可通电的铜棒，通道顶端有信号灯电击（０．３ｍＡ）小鼠，引起逃避反应， 将立即逃至灯光安全区作为正确反应。每天训练２０次，共６ｄ．用ｔ检验法统计各组小鼠每天训 练的正确反应次数，比较其分辨学习能力。另外，还采用一次性被动行为模型［７］和甩尾测痛模 型［８］以比较各组（ｎ＝３０）小鼠的记忆保持能力和痛阈。形态学观察按下王光建等［９］的 方法，每组４只小鼠，在给药后２４ｈ，分别拉断小鼠颈椎，１０％福尔马林溶液作心脏灌流，取 全脑固定，石蜡包埋，冠状面切片，６ｕｍ，焦油紫染色，取垂体柄基部前２００ｕｍ的切面，光 镜观察。粗制线粒体的制备和线粒体膜结合钙测定动物（ｎ＝２４）经药物处理后２４ｈ，断颈处 死，迅速分离下丘脑，脊髓胸段和海马，每２只小鼠的脑组织置Ｔｅｆｌｏｎ玻璃匀浆器中以０． ３２ｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖液匀浆，用差速离心法［１０］制备粗制线粒体，用蛋白一染料结本课题 得到江苏省自然科学基金（６６１）和南京大学现代分析中心测试基金资助合法［１１］快速测定 其蛋白浓度，每管取含８０ｕｇ蛋白的精制线粒体悬液，加生理盐水至２．２ｍＬ，再加入次甲基 四胺缓冲液（０．５ｍｏｌ·Ｌ１，ｐＨ６．２）Ｏ６ｍＬ，４℃过夜。次日，加０．２ｍＬＴｂ Ｃｌ３溶液（０．２ｍｏｌ·Ｌ－１），３７℃水浴１ｈ，用ＨｉｔａｃｈｉＲＦ－５４０型荧光 分光光度仪（λｅｍ＝５４５ｎｍ，λｅｘ＝２９５ｎｍ）测定荧光强度。结果｜３Ｈ｜Ｇｌｕ在 不同组织中的代谢分布用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０层析法分析给药后１０，３０，６０ｍｉｎ小 鼠血清中｜３Ｈ｜Ｇｌｕ的放射性强度表明，Ｇｌｕ在动物体内代谢较快，血清中｜３Ｈ｜Ｇｌｕ 的含量随时程的延长而逐渐减少，１０，３０和６０ｍｉｎ组洗脱曲线的峰值ｃｐｍ数分别为５５ ８０，１９１２和３０６另外，与｜３Ｈ｜Ｇｌｕ标准管洗脱曲线相同，给药后不同时程测得的洗 脱曲线的峰值均在第２４管洗脱液处，但６０ｍｉｎ组的洗脱曲线己出现第２个小峰，说明Ｇｌｕ 已开始分解产生其它物质，但仍以Ｇｌｕ为主．对各种组织中［３Ｈ］Ｇｌｕ代谢分布进行比较（ 图１）表明，肾脏中［３Ｈ］Ｇｌｕ的单位组织摄入量最高，肝脏次之。而神经组织最低，且随着 时程的延长，各组织中［３Ｈ］Ｇｌｕ摄入量的变化有差异．外周组织（肝，肾）的变化与上述血 清中的一致。神经组织的则不同，给药后３０ｍｉｎ时［３Ｈ］Ｇｌｕ的测定值明显低于１０ｍｉ ｎ时的，但与６０ｍｉｎ时的测定值无明显差异，即神经组织内的［３Ｈ］Ｇｌｕ量已不再随血液 中［３Ｈ］Ｇｌｕ量的减少而降低。说明［３Ｈ］Ｇｌｕ已透过血脑屏障进入了神经组织．ＭＳＧ 对学习记忆能力的影响从图２可以看出，在Ｙ－迷宫行为训练中，４．０ｍｇ·－１ＭＳＧ处理组 小鼠ｄ４，５，６的正确反应次数均显著低于对照组的；而２．５ｍｇ·ｇ１ＭＳＧ处理组小鼠仅 ｄ６的正确反应次数与对照组有显著差异由此看来，ＭＳＧ对成年小鼠分辨学习能力有损伤作用， 且损伤程度与用药剂量有关一次性被动回避行为训练和痛阈测定表明，各组小鼠无明显差异（数据 未列出）ＭＳＧ对脑神经元的影响图３Ａ表明，正常小鼠下丘脑弓状核神经元分布均匀，结构完整 ．２．５ｍｇ·９－１ＭＳＧｓｃ对神经元有轻度损伤，表现见图３Ｂ。而４．０ｍｇ·ｇ１ＭＳ Ｇｓｃ则对神经元有明显的损伤作用，神经元肿胀，核固缩，神经元数目明显减少。其塌伤范围亦 向下厅脑腹内侧核及正中隆起扩展（图３Ｃ）．各组海马神经元未见明显损伤ＭＳＧ对小鼠线粒体 膜结合钙的影响结果见表１．２．５ｍｇ·ｇ－１ＭＳＧ对小鼠海马，下丘脑，脊髓的线粒体膜结 合钙均无影响，而４０ｍｇ·ｇ１ＭＳＧ则使小鼠下丘脑，脊髓线粒体膜Ｔｂ３＋荧光强度显著升 高，亦即线粒体膜结合钙显著减少各组海马与对照组无显著差异。讨论Ｇｌｕ在生理ｐＨ值时几乎 处于解离状态，具有很强的极性，一般认为外源性Ｇｌｕ不能透过成年动物血脑屏障［４］，因此 ，尽管Ｇｌｕ在８０年代已被公认为兴奋性毒素之一，但对其能否影响成年动物尚存争论，其神经 毒性作用亦未引起足够重视．本文同位素示踪表明，［３Ｈ］Ｇｌｕ可以透过小鼠血脑屏障进入中 枢神经系统，只是神经系统单位组织的摄入量要比外周组织低．由图１１可以看出，随着反应时程 的延长（３０ｍｉｎ后），神经组织中［３Ｈ］Ｇｌｕ的摄入量不再随血液中［３Ｈ］Ｇｌｕ量的 减少而减少，因此可以排除脑血管内残余［３Ｈ］Ｇｌｕ对实验结果的干扰。但是，由于不同的动 物甚至人都存在着种属差异，所以血脑屏障对Ｇｌｕ的通透性仍有待用不同种属动物进一步研究。 ＭＳＧ对成年小鼠学习记忆能力的影响与幼年小鼠基本一致［９，１２］，但成年动物对ＭＳＧ神 经毒性的敏感性较幼年动物弱，且亦呈明显的剂量依赖关系，即４．０ｍｇ·ｇ１ＭＳＧ对小鼠分 辨学习能力的影响更为明显。因为ＭＳＧ处理组小鼠的痛阈与对照组无明显差异，所以可排除痛觉 传导障碍干扰小鼠回避学习的可能性．各组动物在一次性被动回避行为训练中趋暗行为正常，步入 潜伏期无明显差异，说明Ｍ８Ｇ对小鼠的感光能力和记忆保持能力无明显损伤。但还不能完全排除 小鼠视网膜受到损伤的可能性［１３］．组织形态学观察和线粒体膜Ｔｂ３＋荧光检测表明，４． ０ｍｇ·ｇ１ＭＳＧｓｃ亦仅引起血脑屏障薄弱区域下丘脑的神经元形态和生化指标出现明显变化 ，而与学习记忆密切相关的脑区海马的变化则不明显，说明血脑屏障在防护兴奋性氨基酸进入脑内 损伤神经元的过程中仍起着重要作用，同时出提示学习记忆能力与海马神经元形态学变化之间似无 直接关系，是否有可能下丘脑亦参与了分辨学习的神经机制是一个饶有兴趣的问题。本文验室最近 用Ｓｐｅｘ型ＡＲ－ＣＭ－ＭＩＣ阳离子检测系统对原代培养的神经元内游离Ｃａ２＋浓度的测定 ［１４］，提示ＭＳＧ对神经元的神经毒性效应可能与其诱发胞外Ｃａ２＋内流及胞内钙库释放Ｃ ａ２＋，引起神经元Ｃａ２＋超载，进而破坏线粒体封存和排空Ｃａ２＋的能力，最终导致神经元 死亡有关，另外，最近的研究发现，吗啡［９］，人疱疹病毒［１４］及镧系元素［１５］均可以 增强ＭＳＧ的神经毒性。因此，ＭＳＧ对成年哺乳动物的神经毒性效应及其作用机理值得进一步探讨。参考文献｜｜ＭａｎｅｖＨ，ＣｏｓｔａＥ，ＷｒｏｂｌｅｗｓｋｊＪＴ，ＧｕｉｄｏｔｔｉＡ．Ａｂｕｓｉｖｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ａｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｌｉｍｉｔｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＦＡＳＥＢ
More abstracts about the 谷氨酸单钠对成年小鼠的神经毒性作用