产青霉素酰化酶的大肠杆菌ＡＴＣＣ１１１０５在两水相系统中的动力学性质研究曹学君，孟祥安， 刘彦明，邬行彦（华东化工学院生化工程系上海２１００２３７）姜增莲，杨莉娟（上海药物研究 所上海２０００３２）摘要本文研究了产青霉素酰化酶的大肠杆菌ＡＴＣＣ１１１０５在ＰＥ６２ ００００－ＤｅｘｔｒａｎＴ７０两水相系统中的动力学行为，并与在磷酸盐缓冲液中的动力学行 为进行了对照。产青霉素酰化酶的菌体在两水相体系中的Ｋ＿ｍ值为４．３５ｍｍｏｌ／Ｌ，最适 ｐＨ值为８．０，最适温度为５５℃，最稳定ｐＨ值为６．０～７．０，最稳定温度为３０℃；在 磷酸盐缓冲液中Ｋ＿ｍ值为７．２０ｍｍｏｌ／Ｌ，最适ｐＨ值为８．０，最适温度为６５℃，最 稳定ｐＨ值为８．０，最稳定温度为３５℃。关键词大肠杆菌ＡＴＣＣ１１１０５；两水相系统； 青霉素酰化酶在两水相系统中进行生物转化反应与固定化方法相比具有产物抑制作用小、传质快、 对生物大分子具有稳定作用等优点［１］，近年来在国内外引起注意，有关这方面的报道很多［２ ～７］，但国内从事这一领域的研究则很少。本文研究了产青霉素酰化酶的大肠杆菌ＡＴＣ１１１ ０５在ＰＢＧ２００００－ＤｅｘｔｒａｎＴ７０组成的两水相中的动力学，为探讨在两水相系统 中生产６ＡＰＡ（６－氨基青霉烷酸）的可能作一些基础研究工作。材料与方法一、试剂ＰＥＧ２ ００００：日本进口；ＤｅｘｔｒａｎＴ７０：瑞典进口；对二甲氨基苯甲醛（ＰＤＡＢ）：上海 试剂三厂生产，青霉素Ｇ钾盐：华北制药厂生产；６ＡＰＡ标准品：中国药品生物制品检定所提供 。二、菌体的培养与收集产青霉素酰化酶的大肠杆菌ＡＴＣＣ１１１０５在２８℃培养３０ｈ，培 养基为玉米浆４％、氯化钠０．５％与苯乙酸０．２％组成，ｐＨ７．８～８．０。培养结束，离 心，收集菌体，置４℃冰箱保存待用，酶活为６．１ｕ／ｇ（湿菌体）。三、两水相的配制ＰＢＧ ２００００４．８％，ＤｅｘｔｒａｎＴ７０３．１７％，水９１．５％配成两水相系统。四、酶 活力测定采用ＰＤＡＢ法［８］，ｐＨ７．８，温度３７℃，底物青霉素浓度为２％，反应时间１ ０ｍｉｎ。在７２－１分光光度计上波长４１５ｎｍ处测定消光值。结果与讨论一、表观米氏常数 以青霉素Ｇ钾盐为底物，在０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０的磷酸盐缓冲液及含０．１ｍｏｌ／Ｌ 磷酸盐、ｐＨ８．０的ＰＥＧ２００００－ＤｅｘｔｒａｎＴ７０两水相体系中，３７℃下照酶活 测定方法测定酶反应初速度，数据如表一，用双倒数法作图，如图１。本文为上海节自然科学基金 资助项目（９０）ＢＦ０３８０１的部分工作对表一数据用最小二乘法进行回归处理，算得在磷酸 盐缓冲液中细胞酶的表观米氏常数为７．２０ｍｍｏｌ／Ｌ，两水相系统中表观米氏常数为４．３ ５ｍｍｏｌ／Ｌ．说明在两水相中进行青霉素酰化酶反应较在磷酸盐缓冲液更为有利。二、最适ｐ Ｈ在３７℃下，于不同ｐＨ下测定０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中及含０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐 的两水相体系中照酶活测定方法测定酶反应初速度，绘制成ｐＨ一酶活性曲线（如图２），在缓冲 液中和两水相体系中最适ｐＨ均为８．０左右。三、最适温度在不同的温度下，于ｐＨ８．０的０ ．１ｍｏ１／Ｌ磷酸盐缓冲液中及含０．ｌｍｏｌ磷酸盐ｐＨ８．０的两水相体系中测定酶反应初 速度（除温度外，其它条件同酶活测定一样），绘制温度一酶活曲线（如图３），酶反应在缓冲液 中的最适温度为６５℃左右，在两水相体系中的最适温度为５５℃。四，ｐＨ对酶稳定性的影响将 菌体置不同ｐＨ的０．ｌｍｏ１／Ｌ磷酸盐缓冲液中及含０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐的两水相体系中 ，于３７℃保温１ｈ，取出，离心，收集菌体，测定酶活性，绘制ｐＨ一稳定性曲线如图４。在缓 冲液中ｐＨ６．０～７．０酶最稳定，在两水相体系中ｐＨ８．０酶最稳定。五、温度对稳定性的 影响将菌体分散于ｐＨ８．００．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液及含０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐ｐＨ８ ．０的两水相体系中，于不同温度下保温１ｈ后取出，离心，收集菌体，测定酶活性变化，绘制温 度一稳定性曲线，见图５。随着温度上升，酶活性在缓冲液较两水相体系中降低更快，说明两水相 对酶有一定的稳定作用。通过缓冲液中与两水相体系中青霉素酰化酶动力学比较，可以看出，Ｋｍ 值在两水相体系较缓冲液中低；在不同ｐＨ值下，酶的活性与稳定性在两种体系中无明显差异；温 度对活性及稳定性有显著影响，酶在两水相中的最适温度较缓冲液中低，而酶在两水相中的稳定性 较缓冲液中好。总的看来，在两水相中进行青霉素酰化酶的反应较为有利。由于菌体只分配于两水 相中的一相，而底物与产物均匀分配于两相中，降低了酶的产物抑制作用。另外，在两水相中进行 酶反应与固定化方法相比扩散阻力小、传质快，因而具有明显的优势。有关更深入的研究正在进行 之中。致谢：中国科学院上海生物工程研究中心杨胜利研究员对本项工作给予指导，特此致谢。参 考文献｜｜（１）ＥｌｉｓＡｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ：ＥｎｚｙｍｅＭｉ－ｃｒｏｂＴｅｃｈ ｎｏｌ１９９０；１２：２４２～２５４（２）ＦｏｌｋｅＴｊｅｒｎｅｌｄｅｔａｌ：Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌＢｉ－ｏｅｎｇ１９８５；２７：１０４４～１０５０（３）ＥｌｉｓＡｎｄｅｒｓ ｓｏｎｅｔａｌ：ＥｎｚｙｌｎｅＭｉｃ－ｒｏｂＴｅｃｈｎｏｌ１９８５；７：３３３～３３８ （４）ＹｏｎｇＨｅｅＬｅｅｅｔａｌ：ＪＦｅｒｍｅｎｔＢｉ－ｏｅｎｇ１９９０；６９：８９ ～９２（５）ＩｎｇｒｉｄＰｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ：ＥｎｚｙｌｎｅＭｉｃｒ－ｏｂＴｅｃｈｎ ｏｌ１９８４；６：４１５～４１８（６）ＥｌｉｓＡｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒ－ｏｂＴｅｃｈｎｏｌｌ９８４；６：３０１～３０６（７）Ａｎｎａ－ＬｉｓａＳｍｅ ｄｓｅｔａｌ：ＥｎｚｙｍｅＭ－ｉｃｒｏｂＴｅｃｈｎｏｌ１９８３；５：３３～３６（８）Ｋ Ｂａｌａｓｉｎｇｈａｍｅｔａｌ：ＢｉｏｃｌｉｉｍＢｉｏ－ｐｈｙｓＡＣＴＡ１９７２；２７ ６：２５０～２５６ＳＴＵＤＹＯＮＫＥＮＩＴＣＢＥＨＡＶＩＯＲＯＦＥ．ＣＯＬＩＡＴＣＣ１ １１０５ＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＥＮＩＣＬＬＩＮＡＣＹＬＳＥＩＮＡＱＵＥＯＵＳＴＷＯ－ＰＨ ＡＳＥＳＹＳＴＥＭ￥ＣａｏＸｕｅ－ｊｕｎ；ＭｅｎｇＸｉａｎｇ－ａｎ；ＬｉｕＹａｎ－ｍｉ ｎｇａｎｄＷｕＸｉｎｇ－ｙａｎ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７）ＪｉａｎｇＺｅｎｇ－ｌｉａｎａｎｄＹａｎｇＬｉ －ｙｕａｎ（ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，Ｃｈｉｎ ｅｓｅＡｃａｄｅｉｎｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００３２）ＡＢＳＴＲＡ ＣＴＴｈｅｋｅｎｉｔｉｃｂｅｈａｖｉｏｒｏｆＥ．ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１１０５，ａｐｒｏｄ ｕｃｅｒｏｆＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｃｙｌａｓｅ，ｉｎＰＥＧ２００００－ＤｅｘｔｒａｎＴ ７０ａｑｕｅｏｉｉｓｔｗｏ－ｐｈａｓｅｓｙｓｔ－ｅｍｈａｓｂｅｅｎｓｔｕｄｉｅｄＷｉｔ ｈ０．ｌｍｏｌ／Ｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒａｓｃｏｎｔｒｏｌｓｙｓｔｅｍ．Ｋｍｉ ｎｔｈｅａｑｕｅｏｕｓｔｗｏ－ｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍｉｓ４．３５ｍｏｌ／Ｌ，ｔｈｅｏｐ ｔｉｍｕｍｐＨｉｓ８．０，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓ５５℃，ｔｈｅ ｍｏｓｔｓｔａｂｌｅｐＨｉｓ８．０ａｎｄｔｈｅｍｏｓｔｓｔａｂｌｅｔｅｍｏｅｒａｔｕｒ ｅｉｓ３０６℃．Ｗｈｉｌｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｙａｒｅ７．２０ ｍｍｏｌ／，８．０，６５℃，６．０～７．０，３５℃ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅ ｄａｔａａｒｅｕｓ－ｅｆｕｌｔｏｂｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔ ｈｅｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎｔｏ６－ＡｐＡｉｎｔｈｅａｑｕｏ ｕｓｔｗｏ－ｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍ．ＫＥＹＷＯＲＤＳＥ．ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１１０５；Ａ ｑｕｅｏｕｓｔｗｏ－ｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍ；Ｐｅｎｉｃｌｌｉｎａｃｙｌａｓｅ产青霉素酰 化酶的大肠杆菌ＡＴＣＣ１１１０５在两水相系统中的动力学性质研究@曹学君，孟祥安，刘彦明 ，邬行彦，姜增莲，杨莉娟$华东化工学院生化工程系，上海药物研究所大肠杆菌ＡＴＣＣ１１１ ０５；两水相系统；青霉素酰化酶本文研究了产青霉素酰化酶的大肠杆菌ＡＴＣＣ１１１０５在Ｐ Ｅ６２００００－ＤｅｘｔｒａｎＴ７０两水相系统中的动力学行为，并与在磷酸盐缓冲液中的动 力学行为进行了对照。产青霉素酰化酶的菌体在两水相体系中的Ｋ＿ｍ值为４．３５ｍｍｏｌ／Ｌ ，最适ｐＨ值为８．０，最适温度为５５℃，最稳定ｐＨ值为６．０～７．０，最稳定温度为３０ ℃；在磷酸盐缓冲液中Ｋ＿ｍ值为７．２０ｍｍｏｌ／Ｌ，最适ｐＨ值为８．０，最适温度为６５ ℃，最稳定ｐＨ值为８．０，最稳定温度为３５℃。（１）ＥｌｉｓＡｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ ：ＥｎｚｙｍｅＭｉ－ｃｒｏｂＴｅｃｈｎｏｌ１９９０；１２：２４２～２５４（２）Ｆｏｌｋ ｅＴｊｅｒｎｅｌｄｅｔａｌ：ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉ－ｏｅｎｇ１９８５；２７：１０４４ ～１０５０（３）ＥｌｉｓＡｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ：ＥｎｚｙｌｎｅＭｉｃ－ｒｏｂＴｅｃ ｈｎｏｌ１９８５；７：３３３～３３８（４）ＹｏｎｇＨｅｅＬｅｅｅｔａｌ：ＪＦｅｒｍｅｎ ｔＢｉ－ｏｅｎｇ１９９０；６９：８９～９２（５）ＩｎｇｒｉｄＰｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ：ＥｎｚｙｌｎｅＭｉｃｒ－ｏｂＴｅｃｈｎｏｌ１９８４；６：４１５～４１８（６）ＥｌｉｓＡｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ：ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒ－ｏｂＴｅｃｈｎｏｌｌ９８４；６：３０１～３０６（７）Ａｎｎａ－ＬｉｓａＳｍｅｄｓｅｔａｌ：ＥｎｚｙｍｅＭ－ｉｃｒｏｂＴｅｃｈｎ
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