Ｋ－神经毒素是银环蛇（Ｂｕｎｇａｒｕｓｍｕｌｔｉｃｔｕｓ）蛇毒的基本成分刘洁生，张旭辉， 王争放，张宏，陈式（暨南大学生物系，５１０６３２，广州）摘要利用层析法分别从浙江、湖南 和安徽产银环蛇毒中纯化得到的Ｋ－神经毒素（Ⅵ１ｂ和Ⅷ１ａ峰），分子量均为６５００．两个 Ｋ一神经毒素在浓度１５０ｎｍｏｌ／Ｌ都能有效地阻断小鸡睫状神经节的烟碱传递，经２小时冲 洗仍未见神经节传递功能的恢复。可以认为Ｋ一神经毒素是银环蛇蛇毒的基本成分。关键词：Ｋ一 种经毒素；神经元烟碱乙酰胆碱受体；睫状神经节中图分类号：Ｒ９９１Ｋ一神经毒素（Ｋ一ＮＴ ）家族的首个成员Ｋ一银环蛇毒素（Ｋ一ＢＧＴ）是１９８３年从台湾蛇毒中发现的￣［１］．目 前Ｋ一ＢＧＴ已成为唯一的可用于烟碱受体的分型工具￣［２］，它能高效地识别ａ＿３β＿２亚 型的神经元烟碱乙酰胆碱受体，世界范围内仅我国大陆东南部及台湾省有银环蛇分布，台湾近年蛇 源枯竭，大陆产银环蛇毒必将成为制备Ｋ一ＮＴ的重要来源，我们虽已从广东产蛇毒中找到Ｋ一Ｎ Ｔ￣［３］，但由于蛇毒中Ｋ一ＮＴ的含量极低，一般仅占０．１％，而蛇毒的成分又可因产地不 同而有所不同，Ｋ一ＮＴ是否普遍存在于不同产地的银环蛇毒中，是必须关注的问题。为此，我们 选取了银环蛇产地的东面、北面、中部三个地点即浙江、安徽、湖南所产蛇毒，以相同条件进行分 离，以了解Ｋ一ＮＴ是否为银环蛇毒的基本成分．１材料和方法１．１粗毒的分离及Ｋ一神经毒素 的纯化浙江产银环蛇毒购自浙江金华曹宅养蛇场，湖南产银环蛇毒购自广西医学院蛇毒研究室，安 徽产银环蛇毒购自安徽石台南源养蛇场。５００ｍｇ粗毒溶于３～４ｍｌ２５ｍｍｏｌ／ＬＮＨ＿ ４ＡＣ（ｐＨ５．０）起始缓冲液溶液后离心（３０００ｒ／ｍｉｎ），取上清液加入浚甲基纤维 素ＣＭ一５２柱（１．５ｃｍｘ３０ｃｍ）进行直线梯度洗脱，柱层析条件见表１．收集所得的Ⅵ 峰和Ⅷ峰再分别经羧甲基纤维素ＣＭ一５２柱和羧甲基葡聚糖凝胶Ｃ一５０柱层析，条件见表１． 收集的组分以紫外分光光度计在２８０ｎｍ处测定光吸收值，并绘出层析图。活性组分经脱盐后冷 冻干燥备用。国家自然科学基金资助项目；国务院侨办基金资助项目１．２ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝 胶电泳鉴定分子量ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳采用５％～３０％浓度梯度，依Ｃｈｉａｐｐｉｎ ｅｌｌｉ的方法￣［２］ａ一ＢＧＴ和Ｋ一ＢＧＴ标准品在Ｃｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉ实验室制备 ．１．３电生理鉴定方法２０日龄小鸡睫状神经节置于浴槽中以２２～２３℃生理缓冲液（ＮａＣ ｌ１５０，ＫＣｌ３，ＣａＣｌ＿２，５，ＭｇＣｌ＿２１，Ｈｅｐｅｓ１０，葡萄糖１０ｍｍｏ ｌ／Ｌ）充氧灌流，通过吸附电极刺激节前动眼神经，在节后神经记录动作电位￣［２３］。１． ４蛋白含量测定在波长２８０ｎｍ下进行紫外吸收检测，采用以下消旋系数计算蛋白含量：Ｋ一Ｂ ＧＴ：０．８１６，ａ一ＢＧＴ：１．３２；未知混合组分采用１．００．２结果２．１互一神经 毒素的纯化和电泳鉴定浙江、安徽、湖南产银环蛇毒经羧甲基纤维素ＣＭ一５２柱层析后，一般可 分离为１２～１３个蛋白峰（图１～３）．各组分蛋白含量在三产地银环蛇毒中有所不同（表２） ，Ⅶ峰之前的峰形较相近，而Ⅸ峰以后则有较大差别．浙江产银环蛇毒的Ⅷ峰显著大于另两产地的 蛇毒。三产地蛇毒均在Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ峰中含有分子量为６５００的组分，表明这种组分是蛇毒的基本 成分。收集Ⅵ峰，再上羧甲基纤维素ＣＭ一５２柱层析，获两个主要蛋白峰（图４），经电泳鉴定 ，Ⅵ１峰含有分子量为６５００的组分Ⅵ１峰再经羧甲基葡聚糖凝胶Ｃ一５０柱层析后，获得两个 蛋白主峰中的Ⅵ１ｂ在ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一条带，分子量为６５００（图５～６ ）。浙江产蛇毒的地峰蛋白含量较高，含有分子量为６５００的组分，因此对此峰作了进一步分离 提纯，Ⅷ峰经羧甲基纤维素ＣＭ一５２柱层析后，获两个主峰（图７，其中Ⅷ１含有分子量为６５ 侧的组分，Ⅷ１再经按甲基葡聚糖凝胶Ｃ一５０柱层析后亦分离为两个主要蛋白峰（图８），其中 Ⅷ１ａ经ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为分子量６５００的均一组分（图９）。２．２Ｋ一神 经毒素的电生理鉴定采用鸡胚睫状神经节测定Ⅵ１ｂ和Ⅷ１ａ峰的生理活性，用吸附电极将神经节 的节前和节后纤维固定，刺激节前纤维，在节后纤维可记录到稳定的电变化，以１５０ｎｍｏｌ／ ＬⅥ１ｂ和Ⅷ１ｄ置换正常灌流液时，均可阻断神经节的烟碱传递，阻断效应２０分钟内出现，作 用３０一４５分钟后，传递完全阻断，此后经２小时的冲洗，传递功能仍不能恢复（图１０一１１ ）．图中箭头所指的振幅较小，持续时间较短的反应是电反应，是由间隙接头所产生的，不受Ｋ一 神经毒素的影响，箭头之前是刺激伪迹，箭头之后经一定潜伏期后出现的是节后神经的动作电位。 ３讨论Ｃｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉ与陈式￣［３］在分离广东产银环蛇责制备Ｋ一ＮＴ时，采用了 两次常压液层析，一次高压液相层析，本文采用了三次常压液相层析，亦能制备得电泳纯的、具阻 断神经节烟碱传递功能的Ｋ一ＮＴ。采用高压液相层析的优点是能初步推断所获得的Ｋ一ＮＴ是否 为Ｋ一ＮＴ家族中的新成员。但其设备要求较高。迄今已发现的Ｋ一ＮＴ家族的４个成员：Ｋ一银 环蛇毒素是从台湾产银环蛇毒中纯化的￣［１］；Ｋ＿２一银环蛇毒素与Ｋ＿３一银环蛇毒素来自 广东产银环蛇毒￣［３］，Ｋ一ｆｌａｖｉｔｏｘｉｎｌｑ则是马来西亚红头环蛇的毒性组分。因 而揭示不同产地的银环蛇毒所含的Ｋ一ＮＴ的一级结构可能具有差异。由于我们尚未对本文从浙江 、湖南、安徽产的银环蛇毒纯化得到的多个Ｋ一ＮＴ进行氨基酸序列测定，因而尚无法判断这些Ｋ 一ＮＴ中是否有Ｋ一ＮＴ家族的新成员，但也不排除这种可能性。我们致力于寻找Ｋ一ＮＴ的新成 员，其意义在于对Ｋ一ＮＴ的功能基团及部位有更多的了解，这会有助于对神经元烟碱受体的结构 与功能有进一步的认识。Ｋ一ＮＴ发现至今仅有１０年，但对其结构与功能已进行了较为充分的研 究，并已成为研究神经节及中枢烟碱乙酚胆碱受体的重要探针，与此同时遇到的难题是Ｋ一Ｎｒ的 材料来源问题，对我国多个省份银环蛇毒研究结果表明，Ｋ一神经毒素是银环蛇毒的基本成分，这 对Ｋ一ＮＴ研究中面临的材料来源的解决具有重要意义。此外，Ｋ一ＮＴ是高效的交感神经节拮抗 剂，提示我们在抢救银环蛇伤中，不仅要注意ａ一银环蛇毒素的呼吸肌麻痹作用，还应考虑Ｋ一Ｎ Ｔ引起的毒性效应。参考文献｜｜１ＣｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉＶＡＫａｐｐａ－ｂｕｎｇｒｏｔ ｏｘｉｎ：ａｐｒｏｂｅｆｏｒｔｈｅｎｅｕｒｏｎａｌｎｉｃｏｔｉｎｉｃｒｅｏｅｐｔｏｒｉ ｎｔｈｅａｖｉａｎＣｉｌｉａｒｙｇａｎｇｌｉｏｎ．ＢｒａｉｎＲｅｓ，１９８３，２７７： ９～２１２ＣｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉＶＡ．Ｎｅｕｒｏｔｘｉｎｓａｃｔｉｎｇｏｎａｃｅｔｙ ｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｏｅｐｔｏｒ．Ｉｎ：ＮａｔｕｒｅａｎｄＳｙｎｔｈｅｔｉｃＮｅｕｒｏ ｔｏｘｉｎｓＮｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓｅｄｉｔｅｄｂｙＨａｒｖｅｙＡＬ．Ａｃａｄｅｍｉｃｐ ｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９３，６６～１０９．３ ＣｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉＶＡ，Ｗｏ ｌｆＫＭ，ＧｒａｎｔＧＡ，ＣｈｅｎＳＪＫ＿２－ＢｕｎｇａｒｏｔｘｉｎａｎｄＫ＿３－ｂｕ ｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ：ｔｗｏｎｅｗｎｅｕｒｏｎａｌｎｉｃｏｔｉｎｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒａ ｎｔａｇｏｎｉｓｔｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｖｅｎｏｍｏｆＢｕｎｇａｒｕｓｍｕｌ ｔｉｃｉｎｃｔｕｓ．ＢｒａｉｎＲｅｓ，１９９０，５０９：２３７～２４８４Ｃｈｉａｐｐｉ ｎｅｌｉＶＡ，ＷｏｌｆＫＭ，ＤｅＢｉｎＪＡ，ｅｔａｌ．Ｋａｐｐａ－ｆｌａｖｉｔｏｘｉｎ ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｎｅｕｒｏｎａｌｎｉｃｏｔｉｎｉｃｒｅｏｅｐｔｏｒａｎ ｔａｇｏｎｉｓｔｔｈａｔｉｓｓｔｒｕｅｔｕｒａｌｌｙｒｅａｔｅｄｔｏｋａｐｐａ－ｂｕｎ ｇａｒｏｔｏｘｉｎ．ＢｒａｉｎＲｅｓ，１９８７，４０２：２１～２９ＫＡＰＰＡＮＥＵＲＯ ＴＯＸＩＮ－ＢＡＳＩＣＣＯＭＰＯＮＥＮＴＯＦＢＵＮＧＡＲＵＳＭＵＬＩＣＩＮＣＴＵＳＶＥ ＮＯＭ￥ＬｉｕＪｉｅｓｈｅｎｇ；ＣｈａｎｇＸｉｈｕｉ；ＷａｎｇＺｈｅｎｇｆａｎｇ；Ｃｈ ａｎｇＨｏｎｇ；ＣｈｅｎＳｈｉｊｉｕ（Ｄｅｐｔ．ｏｆＢｉｏｌｇｙ，ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ，５１０６３２，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ）ＡＢＳＴＲＡＣＴＴｗｏＫａｐｐａ－ｎｅｕ ｒｏｔｏｘｉｎｓ，ｐｅａｋⅥ１ｂａｎｄｐｅａｋⅧ１ａｗｉｔｈａｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉ ｇｈｔｏｆ６５００ｄａｌｔｏｎｈａｄｂｅｅｎｐｕｎｆｉｅｄｆｒｍＢｕｎｇａｒｕｓｍｕｌ ｔｉｃｉｎｃｔｕｓＶｅｎｏｍｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎＺｈｅｊｉａｎｇ、ＨｕｎａｎａｎｄＡ ｎｈｕｉｐｉｒｏｖｉｎｃｅｓｂｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂｏｔｈ．Ｋ一ＮＴｓｂｌ ｏｃｋｅｄｔｈｅｎｉｃｏｔｉｎｉｃｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｃｈｉｃｋｃｉｌｉ ａｒｙｇａｎｇｌｉｏｎａｔａｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１５０ｎＭ，ａｎｄｎｏ ｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄａｆｔｅｒ２ｈｏｕｉｓ＇ｗａｓｈｉｎｇ．Ｉｔｉｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔＫａｐｐａ一ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｉｓａｒｅｂａｓｉｃｃｏｍｐ ｏｎｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓｖｅｎｏｍ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：Ｋ一ｎｅｕｒｏｔｏ ｘｉｎ；ｎｅｕｒｏｎａｌｎｉｃｏｔｉｎｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｃｈｉｃｋｃｉｌｉａｒｙｇ ａｎｇｌｉｏｎK－神经毒素是银环蛇（Bungarusmultictus）蛇毒的基本成分@刘洁生，张旭辉，王争放，张宏，陈式$暨南大学生物系Ｋ一种经毒素；神经元烟碱乙酰胆碱受体；睫状神经节利用层析法分别从浙江、湖南和安徽产银环蛇毒中纯化得到的Ｋ－神经毒素（Ⅵ１ｂ和Ⅷ１ａ峰），分子量均为６５００．两个Ｋ一神经毒素在浓度１５０ｎｍｏｌ／Ｌ都能有效地
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