赤子爱胜蚓纤溶酶对大鼠血小板聚集性的药理作用观察首都医学院附属北京同仁医院中心实验室姜东 胜，刘复强，赵相印中国医学科学院肿瘤医院内科孔维红上海医科大学药学院药理学教研室王珏英 ，陈滨凌，卢静提要：利用动物体内和体外不同的实验模型研究发现用赤子爱胜蚓纤溶酶给动物灌 胃或静脉注射，均表现出显著的抗血小板聚集效应，表明本提取物在一定程度上具有抗凝血作用。 另外，我们利用体外模拟血栓形成条件实验模型方法观察发现，蚯蚓纤溶活性成分尚有明显的抗血 栓形成药理作用，对蚯蚓纤溶活性成分进一步研究和开发有可能为血栓性疾病的预防和治疗提供一 种新型药物。关键词：蚯蚓；血小板聚集；实验性血栓分类号：Ｒ９７３．２血管栓塞性疾病是导 致死亡和残废的主要原因之一，寻找有效、低毒、价廉的抗栓、溶栓药物是目前该领域研究的一个 热点。自１９８３年日本ＭｉｈａｒａＨ首次报道了蚯蚓体内含有大量纤溶活性成分以来，蚯蚓纤 溶成分的特殊性已引起国内学者很大的兴趣和关注，陆续发表了一些有关的初步研究结果［１～３ ］。但是，在已报道过的文献中，除了提取物纯化方法较原始外，对其动物的实验药理作用也缺乏 系统研究。我们在研究中采用凝胶过滤方法进行纯化，样品纯度高、活性大，本研究旨在对蚯蚓纤 溶成分的抗凝血活性作进一步的了解。１材料和方法１．１材料蚯蚓纤溶酶（ＥＦＥ）由本实验室 制备；ＳＤ大鼠和Ｗｉｓｔａｒ大鼠由中科院上海动物中心提供。１．２方法血小板聚集性测定参 照石琳等方法［４］。富血小板血浆（ＰＲＰ）及贫血小板血浆（ＰＰＰ）的制备：大鼠用戊巴妥 钠４０ｍｇ／ｋｇ体重（ｉｐ）进行麻醉，从颈总动脉取血后用３．８％柠檬酸钠按１：９体积抗 凝，然后离心（８００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ），取乳白色上清液即得到ＰＲＬ余下的血再离心（ ３０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），取上清即制成ＰＰＰ。取ＰＲＰ在显微镜下计数，用ＰＰＰ 调节血小板浓度为２．０×１０１１～２．５×１０１１／Ｌ。血小板聚集功能的测定指标：血小 板聚集程度用血小板最大聚集率表示，即以ＰＲＰ的透光度作为０％，以ＰＰＰ的透光度作为１０ ０％。给药后血小板聚集程度的变化以血小板聚集抑制率（％）表示：３ｍｉｎ有效解聚率的测定 ：按下式计算：诱导剂的制备：ＡＤＰ一次称取用量后，用ｐＨ７．２０．２ｍｌ／ＵＬＰＢＳ配 制成１００μｍｏｌ／国家自然科学基金资助项目Ｌ浓度，以１ｍＬ分装在试管中，低温－２０μ 保存，用时即刻稀释，实验中均采用同批配制的ＡＤＰ，其终浓度为５μｍｏｌ／Ｌ。２）ＥＦＥ 在体外对血小板聚集性的影响用雄性ＳＤ大鼠４０只，体重为２２０±２０ｇ，使用ＭＧ－１７６ 型血栓凝集图仪（香港狮龙电脑公司）。测定前准备：开启仪器，预热３０ｍｉｎ，恒温至（３７ ±１．２）℃，取２００μＬＰＰＰ注入比浊管，置比浊槽内保温，并用仪器测定其血小板浓度是 否符合仪器测试要求。ＥＦＥ对血小板聚集性的影响：取２００μＬＰＲＰ注入比浊管，开启搅拌 ，边保温边注入空白对照液（０．２ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ）或阿斯匹林对照液或ＥＦＥ５ μＬ（剂量见表１），搅拌２ｍｉｎ后加诱导剂１０μＬ，连续记录５ｍｉｎ。３）体内实验取雄 性ＳＤ大鼠１５只，体重为２１０±２０ｇ。大鼠用２％戊巴比妥钠（ｉｐ）麻醉后，股静脉注射 对照液（生理盐水）或ＥＦＥ（剂量为３．２５×１０５Ｕ／ｋｇ），注射量均为０．０２ｍＬ／ ｋｇ体重，注射１５ｍｉｎ后，经颈总动脉取血，按前述操作测定药物在动物体内对血小板聚集功 能的影响（使用Ｃｈｒｏｎｏ－Ｌｏｇ４３０型血小板聚集仪，Ｃｏｕｌｔｏｒ产品）。４）体外 模拟血栓形成条件下观察药物作用取雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重１５０±２５ｇ，共５９只，分 ５组：口服用药的有对照组和实验组２个，静脉用药的设有对照组、尿激酶（ＵＫ）对照组和实验 组３个。给药方法：口服给药，见文献［５］；静脉给药：对照组注射０．２ｍｏｌ／ＬｐＨ７． ４ＰＢＳ或阿斯匹林（剂量为３０ｍｇ／ｋｇ体重），实验组ＥＦＥ剂量为２×１０５Ｕ／ｋｇ体 重，都由股静脉给药。模拟条件及技术指标的控制：使用的聚乙烯塑料管预先经硅油处理，内径为 ４ｍｍ，长２６０ｍｍ，旋转半径约为４０ｍｍ，与水平面形成的夹角为７４°，转速为１７ｒ／ ｍｉｎ，血液在环内流动的线性速度约为４４０ｃｍ／ｍｉｎ。实验中仪器温度保持（３７±０． １）℃，观察时间为１５ｍｉｎ。操作方法：参考Ｃｈａｎｄｌｅｒ方法［６］。大鼠同上进行麻 醉，分离颈总动脉，取血１ｍＬ，置入经硅油处理过的聚乙烯料管内，开启血栓形成仪，１５ｍｉ ｎ后取下旋转环，测量血栓长度及其质量。２结果２．１ＥＦＥ在体外对血小板聚集的作用如表１ 所示，实验组１ｍｉｎ血小板聚集率和最大聚集率比对照组均增高，经统计学处理有显著差异（Ｐ ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），表明ＥＦＥ在体外具有促血小板聚集的作用。２．２体内实验结果 表１ＥＦＥ在体外对ＡＤＰ诱导的血小板聚集的影响ＡＤＰ最终浓度为５μｍｏｌ／ｂ；ｐ＜０． ０５；Ｐ＜０．０１；Ｐ＜０．００１如表２所示，用药组血小板最大聚集率较对照组明显减低， 差别有极显著意义（Ｐ＜０．００１），说明尽管蚯蚓提取物在体外有促血小板聚集作用，但体内 用药后仍可抑制其血表２体内给药后对血小板聚集性的影响Ｐ＜０．００１小板聚集，发挥抗栓作 用。２．３体外模拟条件下ＥＦＥ作用观察口服给药方法见文献［５］；静脉用药结果如表３所示 ：在体外血栓形成过程中，提取物和尿激酶的特征性血栓形成时间（ＣＴＦＴ）和纤维蛋白血栓形 成时间（ＴＦＴ）都较对照组延长，最后形成的血栓长度和重量也较对照组减低，统计处理后差别 均有显著意义，提示ＥＦＥ具有明显的抗栓效应。另外，实验中我们把正常大鼠血液在体外血栓形 成仪中所形成的血栓进行了组织病理结构检查，结果发现其结构与人体动脉中形成的血栓相似，也 是由头、体、尾３部分组成，头部主要是由血小板组成，含有少许的纤维蛋白，体部纤维蛋白增多 ，可见血小板、红细胞混合存在，在其尾部纤维蛋白网罗中有较多的红细胞，这也反映出本实验中 使用的血栓形成仪可模拟体内血栓的形成过程，符合标准。表３ＥＦＥ对血栓形成的影响Ｐ＜０． ０１３讨论我国蚯蚓资源丰富，它易繁殖、生长快，作为药用在我国古代就已有记载，将干蚯蚓入 药后具有降压、解热等功效，也可治疗半身不遂［７］。本课题组自１９８８年以来开始了一系列 有关赤子爱胜蚓纤溶活性成分的研究，用几种方法提取出几种不同纯度的活性物质，并已完成了有 关其活性鉴定和毒性实验等内容。在本实验中采用的Ｃｈａｎｄｌｅｒ方法［６］是一种历史较长 的经典实验模型，它是在体外模拟体内血流状态下观察血栓的形成过程，在本实验中我们对仪器中 形成的血栓进行了组织学检查，发现其结构与体内动脉血栓非常接近，由此认为该模型能够代表体 内血栓形成环境，并且操作方便，是测试抗栓和溶栓药物作用的良好方法。在本课题的研究过程中 ，我们首先观察到提取物在体外对血小板的促凝聚作用，尔后，为了较全面地研究该提取物，我们 设计了本组实验。经研究发现，虽然该提取物在体外对分离的大鼠血小板有促聚集作用，但它对动 物全血仍表现明显的抗凝作用，并且对经全身无论是口服还是静脉用药后分离的大鼠血小板也表现 明显的抑制聚集作用。这种现象的发生是否与整个机体内非常复杂的凝血调节系统及时进行了调整 有关，或者尚存在其他机理，目前尚不清楚，有待于进一步研究和探讨。参考文献｜｜１高云瑞， 孙尚奎，李光泽，等，溶栓丸对象兔实验性血栓形成的影响，中药药理与临床，１９８９，５（２ ）：３６２程牛亮，牛勃，张祖殉，等．地龙提取物对实验性血栓的溶解作用及有效成分的研究． 山西医学院学报１１９８９．２０（４）：２０３３路英华，金汝成，蚯蚓纤溶酶的提取、性质鉴 定和溶血栓的研究．兰州大学学报（自然科学版），１９８６，２２：９５４石琳，吴婵群，杨毓 麟，等，原儿茶醛对血小板聚集性和血小板内ｃＡＭＰ含量的影响．苏州医学院学报，１９８２． ２：１５姜东胜，张国桢，王宝珍，等．赤子爱胜蚓纤溶酶的药理性质探讨，上海医科大学学报， １９９３，２０（１）：１６６ＣｈａｎｄｌｅｒＡＢ，Ｉｎｖｉｔｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｃ ｏａｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｌｏｏｄ－Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｔｈ ｒｏｍｂｕｓ，ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，１９５８，７（２），１１０７江苏新医学院，中药大辞典 ．上海：上海人民出版社，１９７７ＴｈｅＳｔｕｄｙｏｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＥｆ ｆｅｃｔｏｆＦｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＥａｒｔｈｗｏｒｍｏｎＰｌ ａｔｅｌｅｔＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｉｎＲａｔｓ￥ＪｉａｎｇＤｏｎｇｓｈｅｎｇ；ＬｕＦｕ ｑｉａｎｇ；ＺｈａｏＸｉａｎｇｙｉｎ（ＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｏｎｇｒｅ ｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣａｐｉｔａｌｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）ＫｏｎｇＷｅ ｉｈｏｎｇＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣＡＭＳａｎｄＰＵＭＣＷａｎｇＪｕｅｙｉｎｇ； ＣｈｅｎＢｉｎｌｉｎｇ；ＬｕＪｉｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｙ ，ＳｈａｎｇｈａｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｔｗａｓｒｅ ｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｒｉｃｈｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃ ｅｓｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｏｆｅａｒｔｈｗｏｒｍＥｉｓｅｎｉａｆｏｅｌｉｄｅａｎｄｔｈ ｉｓｗａｓａｌｓｏｖｅｒｉｆｉｅｄｉｎｏｕｒｐｒｅｖｉｏｕｓｗｏｒｋａｆｔｅｒｉｔｓｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｓｔｕｄｙｏｆｉｔｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｂｙｖａｒｉｏｕｓｍｅｔｈｏｄｓ．Ｓｏｆａｒ，ｗｅｈａｖｅｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｘｔｒａｃｔｓｏｆｅａｒｔｈｗｏｒｍｆｏｒｓｅｖ
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