银翘散是中医辛凉解表法的代表方,是临床辨证治疗风热型流感的主要方剂。对流行性感冒、肺炎、 支气管炎、扁桃腺炎、腮腺炎等属于中医温热病范畴的病毒性感染疾病等有切实疗效<1>。体内 实验发现银翘散的具有切实的抗流感病毒作用。为进一步研究其抗病毒谱,我们选择了包括鼻病毒 在内的4种呼吸道病毒,观察银翘散体外对多种呼吸道病毒作用,进一步探讨银翘散的抗病毒机理 。1材料和方法1·1材料1·1·1药物银翘散由金银花、桔梗、薄荷、荆芥、连翘、淡豆豉、 牛蒡子(炒)、淡竹叶共九味组成。金银花、桔梗粉碎成细粉,过筛;薄荷、荆芥提取挥发油,蒸 馏后的水溶液另器收集;药渣与其余五味药加水煎煮二次,每次2h,合并煎液,滤过,滤液与上 述水溶液合并,加入金银花、桔梗细粉,混匀,干燥,粉碎成细粉,过筛,喷加薄荷、荆芥穗挥发 油,混匀;银翘散制剂2000rpm离心5min,80℃间歇灭菌备用。病毒唑由湖北省医工 所提供,批号:040804。1·1·2毒种鼻病毒R14型由中国医学科学院病毒所分赠,原 毒种为美国ATCC提供,在国家鉴定之KMB17双倍体细胞中传代,于33℃,5%CO2恒 温箱培养;流感病毒FM1株由中国医学科学院医药生物技术研究所提供,于MDCK狗肾细胞传 代,以病变及鸡红血球血凝法来判断其滴度,在35℃,5%CO2培养箱培养;呼吸道合胞病毒 毒种由广州市儿童医院病毒实验室提供,为RSV-N3株,于Hep-2细胞上扩增,并进行测 定;腺病毒3型毒种来源同鼻病毒,并于Hela细胞上传代,滴定与检测。1·1·3细胞人肺 KMB17原代细胞株第18代,由中国医学科学院昆明生物制品研究所分赠;狗肾细胞株(MD CK),由广东省防疫站病毒室赠送;Hep-2细胞为本所病毒实验室保存细胞株;Hela细 胞,引自中科院上海细胞库。1·2方法对病毒致细胞病变的体外抗病毒作用试验在96孔微量板 上进行,每孔0·1ml,细胞数为1~3×105个,长成单层后,将银翘散药液用维持液稀释 成不同浓度,抛掉原培养液后将不同浓度银翘散药液加入细胞孔中,0·1ml/孔,以细胞不出 现病变的最小稀释度为该药液对细胞无毒界限。通过毒性试验观察到银翘散7·81g/L和病毒 唑25mg/L浓度对4种细胞生长无明显影响,同时在相应敏感细胞上测定攻击病毒之TCID 50。试验时设病毒对照、细胞对照、药物毒性对照及三氮唑核苷(病毒唑)对照,置CO2培养 箱内,每天在倒置显微镜下观察病变并记录。当病毒对照孔细胞出现+++病变时,继续观察4d 则终止。细胞出现病变的程度按以下6级标准记录:-为细胞生长正常,无病变出现;±为细胞病 变少于整个单层细胞的10%;+为细胞病变约占整个单层细胞的25%;++为细胞病变约占整 个单层细胞的50%;+++为细胞病变约占整个单层细胞的75%;++++为细胞病变约占整 个单层细胞的75%以上。2结果对病毒致细胞病变的体外抗病毒作用结果(见表1)显示银翘散 对鼻病毒、
流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒均未见有抑制病变作用。阳性药病毒唑在无毒浓度 25mg/L时,对以上四种病毒均有很好的抑制作用。该实验重复2次,结果与表1一致。表1银翘散不同浓度对呼吸道病毒致病变抑制作用Table1Loniceraeand Forsythiae Powder effect of pathological changes on Respiroviruses病毒株Virus strain靶细胞Target cellTCID50500g·L-银1翘散1L25ongi·cLer-a1e and31F·o2rs5ygt·hiLae-1powd7e·r81g·L-125病mg毒·L唑-1鼻病毒R14型Rhinovirus type R14KMB1730----+流感病毒A型FM1Influenza virus type AFM1strainMDCK100----+呼吸道合胞病毒RS virus Hep-2100----+腺病毒7型ADvirus type7Hela100----++:表示抑制;±:表示不肯定;-:表示不抑制。3讨论急性呼吸道感染(Acute respiratory infection,ARI)是世界范围的常见病、多发病,主要由流感病毒及其它呼吸道病毒引 起,也是小儿就医和死亡的重要原因之一<2>。现已知道引起ARI的病毒有10多种,240 多个血清型,包括了鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等。几乎所有的人 类病毒都可在离体细胞培养上复制,迄今所有抗病毒试验都需要首先在细胞培养中进行试验,检测 药物对病毒的直接作用,体外实验重复性好,稳定可控,适合多种病毒的分离增殖,应用范围广泛 <3>。本实验结果虽然显示银翘散在体外细胞水平未见有直接的抑制呼吸道病毒的作用,但体内 实验已证实了其确有抑制小鼠体内流感病毒增殖的作用<4>,而且药效及毒理研究也表明银翘散 具有抗菌、抗炎、抗过敏、镇痛、增强免疫等疗效<5>,较之单纯发挥抗病毒作用的合成药如病 毒唑、金刚烷胺等来说,银翘散可以双管齐下,既消除流感引起的症状,且对病毒性感冒具有病因 治疗作用,无明显的毒副作用,因此具有更好的临床应用前景。体外实验结果不能和体内实验结果 相吻合,考虑以下两点原因:(1)目前中药复方体外实验的习惯做法是直接将中药粗提物加入反 应体系中进行评价,而中药原药液本身的许多理化性质,如所含杂质,鞣质、离子等会对实验体系 产生直接干扰<6>,而且有些中药须于体内转化后方发挥抗病毒作用<7>,因此,采用动物口 饲中药后一定时间采血,分离含药血清进行体外实验,可有针对性的克服体外实验的上述缺点,从 而模拟药物代谢的体内过程,使所得结果更加科学可靠,符合临床特点。(2)考虑到细胞培养试 验难以检测药物通过对宿主防御机能的影响,因此我们推测银翘散可能没有直接的抗病毒作用,而 是通过诱生干扰素,增强细胞免疫等而发挥抗病毒感染效果。以上两点应在进一步研究银翘散或其 他有确切临床疗效中药复方的抗病毒机理时应予考虑到。银翘散对多种呼吸道病毒作用体外实验研究@谢斌$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@杨子峰$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@陈俏妍$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@刘妮$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@黄碧松$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@朱宇同$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405目的观察银翘散对多种呼吸道病 毒导致细胞病变的抑制作用,进一步探讨银翘散抗病毒机理。方法分别接种鼻病毒R_(14)型 、流感病毒A型FM1株、呼吸道合胞病毒、腺病毒7型于KMB17、MDCK、Hep-2、 Hela细胞,观察银翘散体外对多种呼吸道病毒作用。结果在4种培养细胞上,银翘散对4种呼 吸道病毒株均未见明显的抑制病毒致细胞病变的作用。结论银翘散在体外对多种呼吸道病毒的增殖 未显示抑制作用,结合体内抗病毒有效的结果,认为将来银翘散抗病毒机理研究方向可调整为以含 药血清进行研究,模拟药物代谢的体内过程,使结果更符合临床特点,也可考虑银翘散可能通过对 宿主防御机能的影响而发挥抗病毒感染效果。
银翘散;;体外;;
呼吸道病毒;;研究方向<1>郑益民·银翘散治病毒性感染验案举隅
·中成药·1994,16(5):43~44·
<2>Johnson CD,Kudsk KA,Fukatsu K,et al·Route of nutritioninfluences gener-ation of antibody-forming cells andinitial defense to an active viral infec-tion inthe upper respiratorytract·Ann Surg·2003,237(4):565~573·
<3>郭元吉·流行性感冒病毒及其实验技术·北京:三峡出版社,1997,11·
<4>杨子峰,黄碧松,刘妮,等·银翘散抗甲1型流感病毒作用的实验研究·中国热带医学,2005,5(7):1423~1424·
<5>石钺,石任兵,刘斌,等·银翘散抗流感病毒有效部位群总黄酮含量的测定·北京中医药大学学报,2001,2(24):44~45·
<6>崔晓兰,贺玉琢,高英杰,等·中药复方血清药理研究方法学探讨-Ⅰ·中国实验方剂学杂志,1998,4(2):13~15·
<7>王喜军·中药及中药复方的血清药物化学研究·世界科学技术-中药现代化,2002 ,4(2):1~4·可靠,符合临床特点。(2)考虑到细胞培养试验难以检测药物通过对宿主 防御机能的影响,因此我们推测银翘散可能没有直接的抗病毒作用,而是通过诱生干扰素,增强细 胞免疫等而发挥抗病毒感染效果。以上两点应在进一步研究银翘散或其他有确切临床疗效中药复方 的抗病毒机理时应予考虑到。银翘散对多种呼吸道病毒作用体外实验研究@谢斌$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@杨子峰$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@陈俏妍$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
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@黄碧松$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405
@朱宇同$广州中医药大学热带医学研究所!广东广州510405目的观察银翘散对多种呼吸道病 毒导致细胞病变的抑制作用,进一步探讨银翘散抗病毒机理。方法分别接种鼻病毒R_(14)型、流感病毒
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