近来,大量证据表明核转录因子κB(NF-κB)在心力衰竭的发病中通过介导TNF-α等炎症 因子引起心肌细胞调亡<1>,但目前尚无特异性药物。己酮可可碱(PTX)是甲基黄嘌呤衍生 物,主要用于治疗血管性疾病。近期研究显示PTX对心衰患者有益,能够改善心功能。但该药对 凋亡心肌细胞的直接影响尚未见报道。2004年4~12月,我们观察了PTX对NF-κB介 导的新生大鼠心肌细胞凋亡的影响,现报告如下。1材料与方法1.1实验材料1~3d龄新生SD大鼠仔鼠(同济医学院动物中心),高糖DMEM、新生牛血清(美国G IBCO公司),PTX(武汉海特生物公司),胰蛋白酶
,重组大鼠TNF-α(peprotech公司),逆转录聚合酶链式(RT-PCR)试剂盒<日本T aK ara宝生物工程(大连)有限公司>,T rizo l(M o lecu lar R esearch Center公司),余试剂均为市售分析纯产品。1.2新生大鼠心肌细胞的培养无菌条件下取出 心脏、剪碎,0.125%的胰蛋白酶分次消化成单细胞悬液,离心收集沉淀以含10%新生牛血清(NCS)的高糖DMEM培养液悬浮分散细胞,接种到100m l培养瓶,用差速贴壁法于37℃、5%CO2孵箱中培养45m in。离心,再次接种于10%新生牛血清,含100kU/L的青霉素和100m g/L的链霉素的高糖DM EM中,细胞密度约为1×106/L。1.3实验分组上述心肌细胞培养48h后换液,再培养2 4h后分为对照组、实验1组、实验2组、实验3组,分别加入生理盐水及浓度分别为100、200、300g/ml的PTX预处理30m in,再分别用5ng/m l的TNF-α刺激6h。1.4心肌细胞凋亡检测0.125%的胰蛋白酶(含0.02%的EDTA)消化收集细胞,调节细胞密度为1×106/L,按A nnex in V-F ITC凋亡检测试剂说明书进行操作,经流式细胞仪检测其荧光,用标记百分率表示。1.5 NF-κBmRNA含量测定自培养的心肌细胞提取总RNA。采用紫外吸收法进行RNA定量,各 组RNA样品的OD260nm/OD280nm吸光度比值均在1.8~2.0。将2μg的总RNA按Takara公司说明书反转录成为相应的cDNA,取4μl逆转录产物加入特异性引物进行竞争PCR扩增(以GAPDH作为内对照)。NF-κB的引物正义链:5-′TTC CCC ACA CTG TAAACC AA-3;′反义链:5-′AGC AAG TGT AAT CCAATA GC-3′。GAPDH的引物正义链:5-′AAT GCATCC TGC ACC ACC AAC TGC-3;′反义链:5′-GGA GGC CAT GTA GGC CAT GAG GTC-3′。扩增产物于琼脂糖凝胶中电泳,确定目标DNA,以凝胶分析系统拍摄分析。1.6 统计学处理数据均以x±s表示,采用SPSS11.0统计软件进行析因分析,用单因素方差分 析各因素的单独效应,组间两两比较用t检验,P<0.05为差异有显著性,P<0.01为差 异有极显著性。2结果2.1心肌细胞凋亡情况对照组、实验1~3组心肌细胞的凋亡率分别为2 5.82%±1.98%、20.78%±1.29%、15.73%±1.29%、10.03 %±2.13%,均较对照组明显降低(P均<0.01);实验2、3组凋亡率低于实验1组( P<0.01),实验3组低于实验2组(P<0.01)。即随PTX浓度增加,心肌细胞凋亡率逐渐降低。2.2NF-κB mRNA含量比较对照组、实验1~3组心肌细胞的NF-κB mRNA分别为0.9701±0.0295、0.8342±0.0089、0.7449±0. 0373、0.5923±0.0290。实验1~3组含量较对照组明显降低(P<0.01) ;实验2、3组含量较实验1组明显降低(P<0.01);实验3组较实验1组明显降低(P<0.01)。即随PTX浓度增加,NF-κBmRNA表达逐渐降低。3讨论S liw a等首次报道了采用PTX随机双盲安慰剂对照治疗扩张型心肌病心衰,证实该药能够改善心功能,降低血TNF-α浓度。随后该课题组相继报道:在合用地高辛、ACE I和卡维地洛基础上,PTX进一步改善该类患者的心功能;重度心衰患者同样受益,且伴有血TNF-α和凋亡信号受体Fax/A po-1浓度降低。离体试验表明:PTX抑制类毒素诱导的人单核细胞TNF-α生成。然而PT X对凋亡心肌细胞的直接影响尚未见报道。本实验以培养的离体心肌细胞为对象,通过流式细胞计 数方法证实PTX对心肌细胞的直接作用是抑制NF-κB诱导的细胞凋亡。凋亡是在基因调控下 由多种促凋亡和抗凋亡的因素共同作用的主动性死亡。TNF-α诱导的心肌细胞凋亡主要通过NF-κB介导的途径。阻滞NF-κB可使凋亡率降低。Satoshi SAKA I等证实抑制心肌细胞NF-κB的活化可下调TNF-α的表达,从而保护受损的心肌细胞。有实 验证实心肌缺血再灌注时,PTX可通过降低NF-κB的活性和TNF-α浓度改善心功能。本 研究发现PTX可显著抑制心肌细胞NF-κBmRNA的表达,从而抑制NF-κB的活性,减 轻心肌细胞凋亡,并呈量-效关系。由此可推测PTX至少是在mRNA水平上通过降低NF-κ B表达,进而抑制NF-κB活化和核转移,从而降低NF-κB的毒性作用,最后达到防止心肌 细胞凋亡的目的。但也有报道认为在内皮细胞和肝实质细胞,阻滞NF-κB可促使细胞凋亡。P TX治疗脑血管病及外周血管疾病已长达30多年,副作用发生率很低,临床用药安全,故治疗心 衰有更广阔前景,但仍需通过大规模的临床试验来评价其安全性及有效性。己酮可可碱对NF-κB介导的新生大鼠心肌细胞凋亡的影响@李爱华$华中科技大学同济医学院附属协和医院!湖北武汉430022
@卢永昕$华中科技大学同济医学院附属协和医院!湖北武汉430022
@罗萍$华中科技大学同济医学院附属协和医院!湖北武汉430022
@刘向阳$华中科技大学同济医学院附属协和医院!湖北武汉430022为探讨己酮可可碱(PT X)对NF-κB介导的心肌细胞的影响,将大鼠心肌细胞体外培养后分为对照组、实验1组、实验2组和实验3组,分别予生理盐水及浓度为100、300、500g/ml的PTX处理。采用流式细胞技术观察细胞凋亡率;采用逆转录聚合酶链式(RT-PCR)测定各组NF-κB mRNA的含量。结果对照组、实验1~3组心肌细胞凋亡率分别为25.82%±1.98%、2 0.78%±1.29%、15.73%±1.29%、10.03%±2.13%,两两比较P均<0.01;NF-κBmRNA分别为0.9701±0.0295、0.8342±0.0089、0.7449±0. 0373、0.5923±0.0290,两两比较P均<0.01。PTX可降低心肌细胞凋亡 率,其机制可能是抑制NF-κB的活性;本研究为PTX治疗心力衰竭提供了理论基础及实验依据。己酮可可碱;;肿瘤坏死因子-;;α心衰;;细胞凋亡<1>Monaco C,Pa leo log E.N uclear factor-κB:a poten tia l therapeu tictarget in atherosclerosis and throm bosis.C ard iovsac R es,2004,61:671-682.
@刘向阳$华中科技大学同济医学院附属协和医院!湖北武汉430022为探讨己酮可可碱(PT X)对NF-κB介导的心肌细胞的影响,将大鼠心肌细胞体外培养后分为对照组、实验1组、实验2组和实验3组,分别予生理盐水及浓度为100、300、500g/ml的PTX处理。采用流式细胞技术观察细胞凋亡率;采用逆转录聚合酶链式(RT-PCR)测定各组NF-κB mRNA的含量。结果对照组、实验1~3组心肌细胞凋亡率分别为25.82%±1.98%、2 0.78%±1.29%、15.73%±1.29%、10.03%±2.13%,两两比较P均<0.01;NF-κBmRNA分别为0.9701±0.0295、0.8342±0.0089、0.7449±0. 0373、0.5923±0.0290,两两比较P均<0.01。PTX可降低心肌细胞凋亡 率,其机制可能是抑制NF-κB的活性;本研究为PTX治疗心力衰竭提供了理论基础及实验依据。己酮可可碱;;肿瘤坏死因子-;;α心衰;;细胞凋亡<1>Monaco C,Pa leo log E.N uclear factor-κB:a poten tia l therapeu tictarget in atherosclerosis and throm bosis.C ard iovsac R es,2004,61:671-682.
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