吡嗪酰胺(PZA)是一种重要的抗结核杆菌的一线药物,对处于酸性环境中缓慢生长的吞噬细胞内 的结核杆菌来说,PZA是目前最佳杀菌药物,这种特性是其他药物不具有的,且使得PZA对于 缩短疗程从12~9个月到目前的6个月有着重要的作用。由于它具有不同于其它抗结核杆菌药物 的一些优点,使得近年来对PZA的研究成为热点。尽管PZA作为抗结核药物已经普遍应用,但 至今人们对于PZA抗结核杆菌的作用机制、作用靶点、结核杆菌耐受机制等还了解甚少。本文就 目前国内外对PZA抗结核杆菌作用机制的研究做了相关归纳如下。一、酸性条件下PZA的抗菌 作用张颖研究后提出了一种PZA的作用机制。PZA进入膜内,通过PZA酶(PZase)转 化为吡嗪酸(HPOA)<1>。HPOA在接近中性pH环境下以阴离子形式(POA-)存在 ,通过被动运输和有缺陷的外排机制扩散到膜外。在酸性条件下,POA-将质子转化成为不带电 荷的HPOA,HPOA又扩散回膜内。HPOA的进入比POA-的外排要多,这导致POA- 在结核杆菌内的积累,HPOA在细菌内外存在一种动态平衡。当HPOA进入到细菌内时带入质 子,导致细胞质的酸化、质子动力的破坏和能量的降低,这种质子动力的破坏抑制了膜对营养物质 的转运功能,使细菌由于缺少营养而死亡。通过检测不同pH值下HPOA的含量、POA-/H POA、PZA的最小抑菌浓度(MIC)<2>,证实了POA-与HPOA之间的动态平衡关 系。除了促进POA-的流入,酸性pH值的另一个作用就是它破坏了细菌本身的膜电位,而且P OA-的出现进一步降低了膜电位,从而影响营养物质的转运,使细菌死亡。不同pH值下细菌的 膜电位也不同<3>,膜电位随着pH值的下降呈下降趋势。在这种机制中,酸性环境不仅降低细 菌本身的膜电位,而且有利于POA-在细菌膜内的积累,更进一步降低膜电位,破坏膜对营养物 质的转运,从而达到PZA对结核杆菌的抑菌作用。在pH值5.5的介质中,PZA的MIC为 50mg/L。PZA发挥作用需要酸性的环境,而体内的病灶恰好具备这样的条件。但是在体外 ,即使在酸性pH环境中,PZA杀菌缓慢且不完全,在培养2周后杀菌不超过76%<4>。这 说明在体内环境中还有其他因素促进PZA的杀菌作用。二、厌氧条件下的PZA的抗菌活性目前 对于PZA的抗菌作用检测都是在有氧条件下进行的,这时的结核杆菌正常生长。而PZA是一种 特殊抗结核药物,它对生长良好的细菌杀菌效果不显著,但对于不生长或生长缓慢的结核杆菌有较 强的杀菌效果。细菌加入PZA后分别在厌氧、缺氧、好氧条件下培养,结果厌氧条件下PZA的 抗菌活性大大增强,厌氧环境对PZA的抗菌活性有促进作用<5>。对于这种现象的解释是结核 杆菌在低浓度氧环境中,电子传递链处于非活化状态,产生很少的能量或者不产生能量,使得结核 杆菌的生长受到抑制,增强了结核杆菌对PZA的敏感性<5>。鱼藤酮、叠氮钠是腺苷三磷酸酶 和呼吸链酶的抑制剂,在pH5.0有氧环境下,它们分别与PZA联合作用于结核杆菌时,PZ A的抗菌活性增强。但当其他条件相同仅改变有氧条件为厌氧条件时,这些抑制剂对PZA的抗菌 活性没有明显影响。这可能是因为在厌氧条件下,细菌的电子传递链活性已经很低,这些抑制剂对 电子传递链的活性影响就不明显了,所以不能促进PZA的抗菌活性。三、PZA的作用靶点研究 PZA的作用靶点曾经被认为是结核杆菌的脂肪酸合成酶Ⅰ(FAS-Ⅰ)<6>,它的功能是以 C16的脂肪酸和乙酰辅酶A为底物合成C24/26的脂肪酸,PZA能抑制这种酶的活性。此 结论是建立在对快速生长的耻垢杆菌及相对应的化合物5-Cl-PZA研究基础上,这种结论最 近被质疑,Boshoff在最近的研究中发现FAS-Ⅰ是5-Cl-PZA的靶点,而不是P ZA的靶点<7>,到目前为止无有效数据能表明PZA有特异的靶点。四、PZA耐受的分子机 制细菌获得耐药性的方式大致有三种类型,即障碍机制(降低细胞膜的通透性和外排泵机制);产 生降解酶或灭活酶类;药物靶位的改变(如某个关键基因的突变)。细菌可通过外源性遗传因子如 质粒或转座子或者染色体自身而获得耐药特性。结核杆菌与多数细菌相似,也是通过上述方式获得 耐药性。结核杆菌特有细胞壁降低多数药物通透性,结核杆菌产生诸如β-内酰胺酶的降解酶类和 其他药物修饰酶。因此,结核杆菌对常见抗生素天然耐药。但是,与其他人类致病菌最显著差别在 于结核杆菌不存在质粒,即无法通过质粒的介导从其他细菌或分枝杆菌获得耐药性。因此,染色体 介导的耐药性是结核杆菌产生耐药的主要形式<8>。很早发现,PZA的耐受株通常都失去了P Zase的活性,Scorpio等学者克隆并测序了编码PZase的基因pncA。在耐PZ A的结核杆菌中,有97%的细菌发生了pncA的突变<9>,发生突变的位点分布在启动子区 域和结构基因的各种位置<1>。其中经常发现由pncA基因第78位(G)、79位(A)和 第143位(A)的缺失而造成的移码突变,还有一些在102位发生的无义突变(C→G),从 而产生一个终止密码子(TAC)<10>。导致PZA耐受的pncA突变位点分布不同,主要分布在pncA的三个区域即3~17位、61~85位、132~142位<9><11>。这些区域可能含有PZase的催化部位。新近的研究表明P.horikoshiipncA(37%的基因序列与结核杆菌相同)的晶体结构对于导致PZA耐受的结核杆菌pncA 基因突变提供了结构上的见解<12>。pncA突变的三个区域可能成簇对应于四个沟中的三个 ,这四个沟搭建了pncA的活性位点平台。残基F13、L19、H57、W68、G97、Y 103、I113、A134及H137呈线型排列成活性部位,预测这些部位的突变也引起酶活 损失,发生在Q10、D12、S104和T142的突变可能会破坏侧链与主链原子间的氢键作 用。在其他部位发生基因突变而引起的酶活损失可能造成活性部位的潜在混乱或者破坏核蛋白<1 2>。当确定了结核杆菌PncA基因的结构时这些猜测就得到了证实。pncA基因最初发生错 义突变,但是插入突变、缺失突变和无义突变也会发生。pncA基因的各种突变特性都可能导致 PZA的耐受,其他药物耐受基因通常不表现这种差异程度。这种突变差异性的基础不清楚,很可 能是因为pncA基因不是主要基因,对于突变位点没有选择压力<13>。尽管对PZA耐受主 要是因为pncA基因中的突变而产生的,但是并不是所有对PZA耐受的菌株都发生了pncA 基因的突变,一些PZase活性呈阴性的菌株pncA基因并没有发生变化,这就表明还有其它 的机制导致PZase失活,进而产生对PZA的耐受<14>。五、展望尽管对于PZA的应用 很广泛,研究也取得了一些进展,但是对于PZA作用于滞留菌的作用机制还没有明确,PZA的 作用靶点也没有确定。相信今后随着研究工作的不断深入,PZA有关的问题都会一一解决,这对 于有效地治疗结核,缩短治疗时间,开发新型的抗结核药物都有着重要的意义。吡嗪酰胺抗结核杆菌作用机制的研究进展!430062武汉$湖北大学生命科学学院@黄蔷
!430062武汉$湖北大学生命科学学院@李顺意
!430030武汉$华中科技大学同济医学院环境医学研究所@徐顺清1Scorpio A,Zhang Y.Mutation in pncA,a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase,cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus.Nat Med,1996,2:662
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