连钱草为唇形科活血丹属植物活血丹Gle-choma longituba(NaKai)Kupr.的干燥地上部分,为《中华人民共和国药典》(20 05年版)一部收载品种。该植物除西北部地区外,我国大部分地区有分布,尤以江苏产量大,质 量优,为江苏产地道药材。因其具有利湿通淋,清热解毒,散瘀消肿之功效,用于热淋、石淋、湿 热黄疸等疾病的治疗<1>,习称为“苏金钱”、“金钱草”,入药配方或作为中药制药的原料。 文献报道连钱草含有黄酮类、三萜类以及挥发油、无机盐等化学成分<2,3>。本文较为系统地 对其所含主要成分三萜酸及黄酮类进行分析测定和品质评价,为连钱草药材及其制剂产品的检验、 质量控制提供分析方法与评价依据。1三萜酸类成分分析连钱草中含有三萜酸类成分主要为熊果酸 ,其次尚含有齐墩果酸。本文采用HPLC-ELSD检测器检测,首次建立连钱草中熊果酸、齐 墩果酸的含量测定方法,结果显示该法灵敏,准确,重现性好。1.1仪器、样品及试药Wate rs-2695型液相色谱仪(四元泵系统,自动进样、在线脱气系统),Alltech-20 00型蒸发光散射检测器,Empower色谱工作站。空气压缩机(北京,中兴汇利),Mil lipore-Q纯水器,梅特勒百万分之一及万分之一电子天平。熊果酸(批号:110742 -200314)、齐墩果酸(批号:09-9803)对照品由中国药品生物制品检定所提供。 甲醇为色谱纯,冰醋酸为分析纯。野生连钱草采自江苏盱眙县铁山寺附近,栽培品采自盱眙县王店 乡,依外观将采自安徽固始县大别山附近连钱草老草、嫩草称为红茎草、青茎草,采集时间均为9 月底。其它市售6批药材由南京同仁堂药厂提供,其中3批(批号:050430、050509 、050528)购自江苏盱眙县,4批(批号:0503180、503190、5424、0506124)购自安徽固始县。药材均由段金廒博士鉴定为唇形科植物活血丹Glechomalongituba(NaKai)Kupr.的干燥地上部分。1.2方法与结果1.2.1色谱条件及系统适应性色谱柱:汉邦Lichrospher5-C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温:30℃,流动相:甲醇∶水∶冰醋酸(83∶17∶0.1),流速:1.0 mL/min,ELSD检测器漂移管温度:72℃,气体流速1.9 L/min。理论塔板数按熊果酸、齐墩果酸峰计算应不低于20 000。1.2.2对照品溶液的配制精密称取减压干燥至恒重的熊果酸、齐墩果酸对照品适量,制成浓度为1.409 2 mg/mL,0.2635 mg/mL的对照品溶液。1.2.3样品处理取本品粉末约2 g(过40目筛),精密称定,置索氏提取器中,加氯仿100 mL,加热回流提取至近无色(6 h),回收溶剂,残渣加甲醇溶解,移至10mL量瓶中,用甲醇定容至刻度。1.2.4方法考察 1.2.4.1线性关系的考察取上述对照品溶液分别进样不同体积,以上述HPLC色谱条件测 定,以浓度的常用对数为横坐标,以峰面积的常用对数为纵坐标,绘制标准曲线,得熊果酸的回归方程为:lgA=1.66lgC+4.04,r=0.9992,结果表明熊果酸在4.227 6~42.276 0μg范围内呈良好线性关系。齐墩果酸的回归方程为:lgA=1.63lgC+5.44,r=0.999 4,齐墩果酸在0.790 5~7.905 0μg范围内呈良好线性关系。1.2.4.2精密度试验取对照品溶液按上述HPLC色谱条件连 续进样6次,测定各峰面积,计算熊果酸、齐墩果酸RSD分别为2.7%、2.8%。1.2. 4.3重复性试验取同一批药材精密称取5份,按上述方法测定,得熊果酸的平均含量为0.23 %,RSD为1.6%;齐墩果酸的平均含量为0.02%,RSD为2.2%。1.2.4.4稳定性试验取连钱草药材供试品溶液,在室温放置0,2,4,8,12,24h后分别进样,以上述色谱条件测定,计算两者峰面积值,RSD分别为2.6%、3.2%。结果表明供试品溶液在24 h之内稳定。1.2.4.5回收率试验取连钱草药材1 g,精密称定,另外精密吸取浓度为1.028 0 mg/mL熊果酸对照品溶液、浓度为0.102 4 mg/mL齐墩果酸对照品溶液各1 mL,分别加入每份样品中,照供试品溶液的制备方法制得溶液,测定,计算回收率,熊果酸的平均 回收率为95.69%,RSD为2.8%(n=6),齐墩果酸的平均回收率为94.71%, RSD为2.9%(n=6)。1.2.5样品测定取不同连钱草药材按上述制备方法制得供试品 溶液,在上述HPLC色谱条件下进样20μL测定,按外标两点法对数方程计算,结果见表1。 表1连钱草药材中熊果酸、齐墩果酸的含量测定结果(n=3)产地样品名称熊果酸含量(%)齐墩果酸(%)江苏盱眙栽培品0.2630.018野生品0.326 0.032050430 0.170 0.013050509 0.213 0.020050528 0.196 0.017安徽固始红茎草0.247 0.017青茎草0.234 0.016050318 0.252 0.025050319 0.167 0.014050424 0.246 0.0270506124 0.250 0.0332黄酮成分木犀草素、芹菜素的分析连钱草的化学成分研究表明其含有丰富的黄酮<2> 。本文采用HPLC-DAD检测器检测,并通过固相萃取(SPE)预处理,纯化了样品,优化 了色谱条件<4>,首次建立连钱草中木犀草素、芹菜素的含量测定方法,同时依据文献对总黄酮 进行了测定<5>。2.1仪器、样品及试剂996型二极管阵列检测器,其它仪器同1.1。SUPELCOC18固相萃取小柱(3 mL)。木犀草素、芹菜素对照品由江苏省中医药研究院中药化学室杨念云博士提供(归一化法测定 含量达98%以上)。乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯。药材来源同1.1。2.2方法与结果2.2.1色谱条件及系统适应性色谱柱:汉邦Lichrospher5-C18柱(4.6mm×250 mm,5μm),柱温:30℃,流动相:乙腈∶0.5%磷酸水(28∶72),流速:1.0 mL/min,检测波长:340nm。理论塔板数按木犀草素、芹菜素计算应不低于10 000。2.2.2对照品溶液的配制分别精密称取减压干燥至恒重的木犀草素、王庆,等:不同产 地连钱草中三萜酸类及黄酮类成分的分析与评价第1期芹菜素对照品适量制成浓度为102.5μg/mL、75.0μg/mL的混合对照品溶液。2.2.3样品处理取本品药材粉末约2.5g(过40目筛),精密称定,精密加入70%甲醇50 mL,加热回流1 h,放冷,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液30 mL,蒸干,加40%甲醇2 mL溶解,以1.5 mL/min流速通过预活化好的固相萃取小柱,用40%甲醇10 mL洗脱,弃去,再用60%甲醇洗脱,收集洗脱液5 mL置容量瓶中,作为供试品溶液。2.2.4方法考察2.2.4.1线性关系的考察取上述对照 品溶液分别进样不同体积,以上述HPLC色谱条件测定,以浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线,得木犀草素的回归方程为:A=3.11×106C-1.09×105,r=0.9999,芹菜素的回归方程为:A=4.09×106C-1.15×105,r=0.999 9,结果表明木犀草素在0.308~2.563μg,芹菜素在0.225~1.875μg范围 内呈良好线性关系。2.2.4.2精密度试验取对照品溶液按上述HPLC色谱条件连续进样6 次,测定各峰面积,两者RSD均为1.2%。2.2.4.3重复性试验取同一批药材精密称取5份,按上述方法测定,得木犀草素的平均含量为0.0495 mg/g,RSD为3.79%,芹菜素的平均含量为0.046 0 mg/g,RSD为3.47%。2.2.4.4稳定性试验取连钱草药材供试品溶液,在室温放置0,2,4,8,12,24 h后分别进样,以上述色谱条件测定,峰面积值的RSD分别为2.6%、2.5%。结果表明供试品溶液在24h之内稳定。2.2.4.5回收率试验取已知含量的连钱草药材1 g,精密称定,另外精密吸取一定浓度的木犀草素、芹菜素混合标准品溶液0.7 mL,分别加入每份样品中,照供试品溶液的制备方法制得溶液,测定,计算回收率,木犀草素的平 均回收率为94.20%,RSD为0.65%,芹菜素的平均回收率为94.13%,RSD为 0.69%(n=6)。2.2.5样品测定取不同连钱草药材按2.2.3制备方法制得供试品 溶液,按2.2.1“HPLC色谱条件下”进样30μL测定,按外标两点法计算,结果见表2 。表2连钱草药材中木犀草素、芹菜素的含量测定结果(n=3)产地样品名称木犀草素/mg·g-1芹菜素/mg·g-1江苏盱眙栽培品0.040.05野生品0.05 0.05050430 0.02 0.02050509 0.14 0.07050528 0.04 0.04安徽固始红茎草0.01 0.01青茎草0.01未检出050318 0.01 0.01050319 0.03 0.02050424未检出未检出0506124 0.04 0.043讨论(1)熊果酸和齐墩果酸均属三萜酸,结构相似,在植物中多同时存在,用薄层及比 色法测定,容易产生干扰,建立HPLC-ELSD法测定含量,可消除末端吸收的影响。测定结 果准确可靠,快速,灵敏,重现性好。(2)经固相萃取预分离,解决了前处理的繁琐操作,纯化 了样品,优化了色谱分离条件,使测定结果准确可靠,快速,灵敏。(3)不同产地连钱草中熊果酸与齐墩果酸的含量分析结果表明:江苏盱眙产连钱草两者含量高于安徽固始药材,其中熊果酸含
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