血管性痴呆(vascular dementia,VD)是指因脑血管病所致的智能及认知障碍临床综合征<1>,主要与缺血性 脑血管病有关。本研究复制脑缺血再灌注VD学习记忆障碍小鼠模型,并于术后7d观察了临床效 方醒脑启智胶囊对模型小鼠行为学、脑组织海马区病理形态学、脑组织海马区脑红蛋白(NGB) mRNA表达的影响,验证醒脑启智胶囊对VD的疗效并探讨其作用机制。1材料与方法1.1材 料1.1.1动物健康雄性昆明小鼠120只,体重28g~32g,由河北省实验动物中心提供 (昆明小鼠二级实验动物,合格证号:DK0412-0112)。1.1.2药物醒脑启智胶囊 由石菖蒲、川芎、橘络、枸杞子组成,为水煎醇沉工艺制作胶囊,每克浸膏相当于中药生药6.2 4g,实验时用0.5%羧甲基纤维素钠配成浓度为184mg/mL和92mg/mL醒脑液。 舒血宁片:每片含银杏叶提取物50mg,广西半宙制药股份有限公司生产(批号:200409 02),实验时用0.5%羧甲基纤维素钠配制成浓度为2.5mg/mL的混悬液。尼莫地平片 为石家庄市华龙药业股份有限公司生产(批号20041017),实验时用0.5%羧甲基纤维 素钠配制成浓度为12.5mg/mL的混悬液。1.1.3主要试剂TRIzol试剂、cDN A合成试剂盒(MBI公司);TapDNA聚合酶(北京赛百盛基因技术有限公司);DL20 00Marker(宝生物工程大连有限公司)。1.1.4主要仪器小鼠电子水迷宫,中国医学科学院药物研究所;XTS20型连续变倍体视显微镜,北京;LEICARM2125型切片机,德国LEICA公司;HM—200型电子天平,日本ANG公司;PCR 扩增仪,美国PE公司;BIO—PROFIF凝胶图像分析系统,法国VL公司。1.2方法1 .2.1模型制备方法将小鼠随机分组:假手术组(S组)、
模型组(M组)、醒脑液高剂量组( H组)、醒脑液低剂量组(L组)、银杏叶液对照组(E组)、尼莫地平液对照组(N组)。参照 文献<2>方法制备反复缺血再灌注VD模型。1.2.2治疗方法术后第2天进行治疗(造模后 M组动物1只死亡)。H组灌服醒脑液1.84g/kg,L组灌服醒脑液0.92g/kg,E 组灌服银杏叶液0.05g/kg,N组灌服尼莫地平液0.04g/kg,S组、M组灌服生理 盐水10mL/kg,每日1次,共治疗7d。1.3行为学实验的检测方法采用电子水迷宫测试 。水迷宫由黑色有机玻璃板制成,水深22cm,水温24℃±1℃,分为终点区、A区、B区、 C区,终点区有台阶供动物爬出水面。每个区至终点作为一个阶段的训练,每个阶段训练3次。记 录5min内动物由C区为起点游至终点区台阶处的游全程所需时间及进入盲端次数(错误次数) ,作为学习成绩。24h后再测游全程所需时间及进入盲端次数(错误次数),作为记忆成绩。1 .4病理切片的制备行为学实验结束后每组取3只小鼠断头处死,脑组织用10%甲醛溶液固定1 2h后,逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,用HE染色,取脑组织相同层面的切片,光镜下观察小鼠脑组织海马区的形态学改变。1.5RT-PCR检测小鼠脑海马区NGBmRNA的表达总RNA的提取,RNA的鉴定,RT反应,扩增引物合成和PCR反应条件及体系 、凝胶电泳。1.6统计学处理数据用均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS统计软件,采 用方差分析、LSD法检验。2结果2.1醒脑启智胶囊对VD小鼠行为学实验的影响小鼠的学习 成绩与记忆成绩改变基本一致。M组小鼠的游全程时间延长,错误次数增加,与S组比较具有统计 学意义(P<0.01);用药各组与M组比较,有统计学意义(P<0.05或P<0.01) 。用药各组之间比较无统计学意义(P>0.05)。详见表1。表1各组小鼠水迷宫实验学习及 记忆成绩比较(x±s)组别n学习成绩游全程时间(s)错误次数(次)记忆成绩游全程时间( s)错误次数(次)S组1240.36±10.592)4.00±1.862)41.17± 9.142)3.92±1.932)M组11129.28±21.8211.58±2.83 126.74±20.281.50±2.94H组1298.74±18.712)8.25± 2.052)97.95±16.392)7.58±2.782)L组12104.96±17 .752)8.75±2.532)106.26±17.292)8.58±2.232)E组 12107.80±21.782)9.08±2.811)108.66±18.651)8. 83±2.861)N组12109.68±20.781)9.25±2.221)109.3 8±19.271)9.33±2.151)与M组比较,1)P<0.05,2)P<0.01 2.2醒脑启智胶囊对拟VD小鼠脑组织海马区病理形态学的影响光镜下病理形态学显示,术后S 组小鼠脑组织海马区锥体细胞及神经纤维排列整齐,结构清晰;M组小鼠脑组织海马CA1区锥体 细胞层次减少,排列稀疏,明显脱失,细胞核体积变小,结构不清。各用药组小鼠病变轻于M组。2.3醒脑启智胶囊对拟VD小鼠脑海马区NGBmRNA表达的影响M组小鼠脑组织海马区NGB mRNA的表达较假手术组增加(P<0.01);各用药组均较M组增加(P<0.05);用药 各组之间比较:H组较L组、E组、N组表达增加(P<0.05或P<0.01),L组、E组、N组各组之间比较无统计学意义。详见表2。表2各组小鼠脑海马区NGBmRNA表达相对含量(x±s)组别nNGB(mRNA)S组90.23±0.101)M组8 0.38±0.11L组90.84±0.142)H组91.12±0.172)3)4)5) E组90.94±0.152)N组90.90±0.122)与M组比较,1)P<0.05, 2)P<0.01;与E组比较,3)P<0.01;与N组比较,4)P<0.01;与L组比 较,5)P<0.013讨论3.1VD模型复制成功本实验在光镜下观察,术后M组小鼠脑组织 海马CA1区锥体细胞层次减少,排列稀疏,明显脱失,细胞核体积变小,结构不清,改变符合V D病理特征。水迷宫实验结果显示,M组小鼠游全程时间均显著延长,错误次数明显增加,与S组 比较具有统计学意义(P<0.01),表明M组小鼠学习成绩和记忆成绩下降。说明脑缺血再灌 注术使M组小鼠学习和记忆能力减退。这与VD的智能水平下降、记忆力减退相符,可模拟人的多 次脑缺血引起的痴呆,说明本实验采用反复结扎双侧颈总动脉方法复制的VD模型,在病理学方面 及其在引起智能水平下降方面是成功的。3.2醒脑启智胶囊组方依据VD属中医学“健忘”“呆 病”“文痴”“癫病”等病证范畴,其病位在脑,与肝肾心脾等脏密切相关,肝肾亏虚为本,痰瘀 凝结为标,为本虚标实之病证。针对本病主要病机,课题组经多年临床筛选具有补益肝肾、化痰祛 瘀等功效药物,研制成醒脑启智胶囊。方中枸杞子具有滋补肝肾、填精益智功效,现代研究表明, 枸杞子具有调节机体免疫功能和抗衰老作用<2>;石菖蒲可化痰开窍,醒神健脑,聪耳益智,现 代研究表明<3>,石菖蒲挥发油有抑制大鼠神经细胞凋亡的作用,可降低小鼠脑组织兴奋性氨基 酸的含量,对痴呆大鼠学习记忆具有显著改善作用<4,5>;川芎为血中之气药,活血行气,现 代研究表明,川芎嗪可通过上调脑缺血再灌注诱导的Bcl-2蛋白表达,下调Fas-L蛋白表 达,抑制细胞凋亡<6>;橘络功擅活血通络,行气化痰。诸药相伍,标本兼治,共奏补益肝肾, 祛瘀通络,化痰开窍之功。3.3醒脑启智胶囊治疗VD的机制Burmester等<7>首次 报道人和小鼠脑内存在功能上类似于肌红蛋白的携氧球蛋白-脑红蛋白,NGB在脑缺氧的适应性 保护过程中起重要作用<8>,同时NGB可增加神经细胞的氧供应,提高神经细胞的存活和功能 。另外,NGB的含量降低可导致神经元对氧的利用率低,对缺氧的耐受性差,有可能是神经细胞 易于变性死亡的一个因素。本研究显示,反复脑缺血再灌后,M组小鼠脑组织海马区NGBmRNA的表达较假手术组增加(P<0.05);说明NGB在脑缺血再灌注的过程中起到适应性的保护作用,验证了脑组织海马区NGBmRNA的改变在VD发病中的作用。各用药组小鼠脑组织海马区NGB mRNA的表达均较模型组增加(P<0.01),表明醒脑启智胶囊通过调节脑组织海马区NGB mRNA的表达,减轻缺血再灌注损伤,从而起到治疗作用。醒脑启智胶囊对实验性VD模型小鼠具有明显的治疗作用,其治疗VD的机制之一是调节脑组织海马区NGB mRNA的表达,减轻缺血再灌注损伤。醒脑启智胶囊对血管性痴呆小鼠海马组织NGB mRNA表达的影响@杨牧祥$河北医科大学中医学院
@武常生$河北医科大学中医学院
@于文涛$河北医科大学中医学院
@徐华洲$河北医科大学中医学院
@胡金宽$河北医科大学中医学院目的探讨醒脑启智胶囊对小鼠脑组织海马区脑红蛋白(NGB)m RNA表达的影响。方法120只昆明种小鼠随机分为假手术组、模型组、醒脑液高剂量组、醒脑 液低剂量组、银杏叶液对照组、尼莫地平液对照组,每组20只。采用双侧颈总动脉结扎反复脑缺 血再灌注的方法制备血管性痴呆小鼠模型。术后7d进行行为学实验和脑组织的病理形态学观察, 并采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测实验小鼠海马组织NGBmRNA的表达。结 果①行为学实验观察显示,模型组小鼠学习成绩与记忆成绩下降,各治疗组小鼠的学习成绩与记忆 成绩均有提高(P<0.05或P<0.01)。②光镜下病理形态学显示,术后模型组小鼠脑组 织海马区呈缺血性病理改变,各治疗组小鼠病变轻于模型组。③模型组小鼠脑组织海马区NGBmRNA的表达较假手术组增加(P<0.05);各用药组均较模型组增加(P<0.01)。
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