扁桃酸是一类重要的药物中间体,可用于合成血管扩张药环扁桃酯、眼科药物羟苄唑、中枢神经兴奋 药匹莫林及苯并二呋喃酮染料。采用生物催化技术进行R型扁桃酸合成,用面包酵母发酵可以将苯 乙酮酸定向地转化为单一构型D-扁桃酸(图1)。图1苯乙酮酸与D-扁桃酸的转化关系笔者利 用毛细管电泳将苯乙酮酸和D-扁桃酸分离,测定面包酵母扁桃酸发酵液中苯乙酮酸和D-扁桃酸 的含量(面包酵母的扁桃酸发酵液简称为扁桃酸培养液),对转化过程进行质量监控。1材料与方 法1·1仪器与试剂高效毛细管电泳仪(105型,俄罗斯LUMEX公司)。L-扁桃酸、D- 扁桃酸(Sigma公司)。苯乙酮酸<中国医药(集团)上海化学试剂公司>,其他试剂均为AR级。称取一定量的D-扁桃酸和苯乙酮酸,用二次去离子水使其溶解,移入容量瓶中,定容,配成10mmol/L的标准溶液。1·2方法1·2·1试样处理面包酵母发酵液离心,微孔滤膜过滤,稀 释。溶液在使用前均需用0·2μm微孔滤膜过滤。1·2·2电泳条件以未涂层石英毛细管(有效长度52·0cm,内径75μm)为分离通道,电泳介质为0·08mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH 9·00),分离电压25 kV,柱温25℃,检测波长214 nm,D-扁桃酸和苯乙酮酸在10 min内实现基线分离。1·2·3缓冲介质的选择用磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、Tris -H3PO4缓冲溶液分别试验,发现在不同缓冲溶液里目标物的分离效果有较大差异,硼酸盐缓 冲溶液分离效果较好,因此选择硼酸盐缓冲溶液作为分离D-扁桃酸和苯乙酮酸的缓冲溶液。1·2·4缓冲液pH值的影响配制硼酸盐缓冲溶液(pH6·5~9·0,浓度0·08mol/L),在分离电压为25 kV时用1·0×10-4mol/L样品考察pH值对分离度的影响(图2)。当pH6·5~9 ·0,分离度随着pH值的变化而逐渐增加,可以实现基线分离;当pH>9·0时,峰形较差,因此选择pH9·0为最佳缓冲溶液pH值,此时D-扁桃酸可以很好地得到基线分离,且保留时间较短。图2 pH值对分离度的影响1·2·5缓冲溶液浓度的影响选取0·02,0·04,0·06,0·08,0·1 mol/L的缓冲溶液(pH 9·0)测试。当缓冲溶液浓度为0·08 mol/L时,可以有效分离且保留时间较好,且没有峰展宽现象发生,所以选择浓度0·08 mol/L硼酸盐缓冲溶液作为运行液。1·2·6电压的影响考察电压的影响。当电压在15~25kV时,毛细管中的电流与外加电压有良好的线性关系(图3)。当电压为25 kV时,分离时间较快,而且峰形较理想。图3分离电压对电流的关系图1·2·7检测波长的选择对D-扁桃酸和苯乙酮酸进行紫外扫描,发现在200~220 nm有较大吸收,波长214 nm,检测时发现其吸收值较大且峰形较好,所以选择波长214 nm进行实验。2结果2·1标准样品分离依据1·2·2中的条件,对标准样品溶液进行分离,标准样品在上述最佳条件下的电泳谱图(图4)。D-扁桃酸和苯乙酮酸在6 min实现完全分离。1:D-扁桃酸;2:苯乙酮酸.浓度1·0×10-5mol/L·分离检 测条件见1·2·2图4标准样品电泳谱图2·2标准曲线各取一定体积的D-扁桃酸和苯乙酮酸 标准溶液稀释至所需浓度后,等体积混合,在最佳分离检测条件下进行测定,以D-扁桃酸和苯乙 酮酸标准溶液峰面积对其浓度作图。以电泳谱图的峰面积(Y)分别对它们的浓度X(mol/L )进行回归分析,得出两组分的检测范围分别为1·0×10-5~2·0×10-3mol/L 和2·0×10-5~1·0×10-3mol/L,相关系数分别为0·9950和0·978 5(n=5),可见峰面积与其浓度有较好的线性关系。此外,以3倍信噪比对应的浓度得到检测限,D-扁桃酸、苯乙酮酸的检测限均为5·0×10-6mol/L。2·3D-扁桃酸发酵液含量的测定面包酵母发酵液样品经预处理后,按照上文所提及的配制方法与实验步 骤,在1·2·2中所述的最佳条件下,连续进样5次。毛细管电泳谱图见图5。在扁桃酸发酵液 中D-扁桃酸和苯乙酮酸可以得到良好的分离。面包酵母能够有效地将苯乙酮酸转化为D-扁桃酸,48h转化率为92·3%,72 h转化率>99·9%。2·4方法的准确度和精密度将不同量的D-扁桃酸、苯乙酮酸的标准溶液 加入到标准样中,作加标回收实验,测定峰面积(A),根据回归方程计算回收率,可得D-扁桃 酸和苯乙酮酸的回收率分别为99·8%和101·0%,RSD分别为1·59%,2·37% (n=5)。本方法用于实际样品中相关成分的同时分离和测定,结果可靠准确,重现性满意。3 讨论目前国际市场上扁桃酸需求量约以年均10%左右的速度增长,是精细化工中间体的研究热点,尤其是单构型扁桃酸的开发,具有良好的应用前景和巨大的发展空间。A:12h B:48 h图5 D-扁桃酸发酵液电泳谱图当前扁桃酸的工业合成,主要采用化学合成路线,得到的都是外消旋体, 要获得单一对映体须进行拆分,但手性拆分费用不菲,且易造成浪费和污染<1-2>。德国BA SF公司采用生物催化技术进行R型扁桃酸合成,主要采用酶催化形式,该方法的一个缺点是由于 辅酶的应用,价格昂贵。解决此难题的有效途径是采用活细胞进行生物催化<3-5>。研究表明 用面包酵母作为活细胞转化较好,可以将苯乙酮酸定向地转化为单一构型D-扁桃酸。本文建立的 实验方法可用于扁桃酸发酵液中D-扁桃酸和苯乙酮酸的分离与测定。方法具有分离时间短、杂质 干扰少、操作简便等优点,且获得比较满意的结果。毛细管胶束电动色谱分离测定扁桃酸和苯乙酮酸@邱彬$福州大学化学化工学院化学系!福州350002
@吴翠敏$福建医科大学药学院化学综合实验室!福州350004
@叶榕$福建医科大学药学院化学综合实验室!福州350004
@陈海军$福州大学化学化工学院化学系!福州350002电泳,
毛细管', 1, 529769)"; href="/tags/%E6%AF%9B%E7%BB%86%E7%AE%A1/">
毛细管;;苯乙酮酸;;扁桃酸 类<1>张楠.手性化合物D-扁桃酸开发前景广阔
.中国化工报,2002-02-21(03).
<2>蒋光祖.对我国开发手性药物的思考.药学进展,1997,21(4):226-228.
<3>Takano N,Matuda K,Itaya M.Bioelectrocatalytic reduction of 3-ketoesters using Baker’s yeast.Denki Kagaku,1998,66(1):86-90.
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<5>Dahl C,Fjeldber GM,Madsen J.Improving the D-stereoselectivityin reduction of 3-oxoesters.Tetrahedron Asymmetry,1999,10(3):551-553.氩舛ū馓宜岷捅揭彝酅邱彬$福州大学化学化工学院化学系!福州350002
@吴翠敏$福建医科大学药学院化学综合实验室!福州350004
@叶榕$福建医科大学药学院化学综合实验室!福州350004
@陈海军$福州大学化学化工学院化学系!福州350002电泳,毛细管;;苯乙酮酸;;扁桃酸 类<1>张楠.手性化合物D-扁桃酸开发前景广阔.中国化工报,2002-02-21(03).
<2>蒋光祖.对我国开发手性药物的思考.药学进展,1997,21(4):226-228.
<3>Takano N,Matuda K,Itaya M.Bioelectrocatalytic reduction of 3-ketoesters using Baker’s yeast.Denki Kagaku,1998,66(1):86-90.
<4>Nakamura K,Matsuda T.Asymmetric reduction of ketones by theacetone powder of geotrichum candidum.J Org Chem,1998,63(24):8957-8964.
<5>Dahl C,Fjeldber GM,Madsen J.Improving the D-stereoselectivityin reduction of 3-oxoesters.Tetrahedron Asymmetry,1999,10(3):551-553.
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