天螺霜是我院通过对民间方剂“天螺汤”有效成分分析,首次以天螺(江西巴蜗牛,Bradyba ena.Jiangxinensis)为原料采用溶剂提取法制取的多糖类生物活性物质<1>。本研究以HBV转染的人肝癌细胞(HepG2)2215细胞株为靶细胞,拟通过体外细胞培养实验观察其对HBV分泌HBsAg和HBe Ag的抑制作用及其细胞毒性。1材料和方法1.1材料与仪器天螺霜由本实验室自制<1>(白 色颗粒状结晶,纯度89·16%,室温下10h硫酸-苯酚法吸收度Rsd=1·47),4℃ 保存;HBV-DNA转染人肝癌细胞2215细胞系引自中国医学科学院生物技术研究所。CO 2培养箱(MCO15A,日本三洋);自动γ免疫计数仪(XH-6010,国营西安二六二厂)。EaglesMEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Hyclone Lab公司);G-418(Geneticin,美国Gibco公司);四甲基偶氮唑盐(MT T,美国Sigma公司);固相放射免疫测定试剂盒(中国同位素公司北方免疫试剂研究所)。 1.2实验方法1.2.1细胞培养<2>在长满2215细胞的培养瓶内加0·25%胰酶37 ℃消化3min,加培养液吹打,1∶3传代,10d长满。取生长良好状态的2215细胞,配 制成1×108·L-1的细胞悬液,每孔1ml接种于24孔细胞培养板,37℃、5%CO2 培养48h后,换用含不同浓度(160、80、40、20、10mg·L-1)天螺霜的培养 液,每浓度加4孔,37℃、5%CO2培养,每3d更换新鲜含药培养液,共2次。8d后收集 上清液,-20℃保存,检测HBsAg和HBeAg,并测定药物的细胞毒性。试验设HBsA g、HBeAg阳性和阴性对照、细胞对照各3孔。1.2.2细胞毒性试验采用MTT法<3> 。于去除上清液的细胞中加入400mg·L-1MTT每孔0·1ml,37℃、5%CO2孵 育4h,可见黄黑色甲臜颗粒。弃去MTT液,加入100%DM-SO0·1ml·well- 1,待甲臜颗粒完全溶解(约10min)后,用紫外分光光度计测光密度A595、A650。 空白对照加4孔100%DMSO0·1ml·well-1。计算细胞存活率和天螺霜的半数毒 性浓度(TC50)。1.2.3HBsAg和HBeAg抑制率测定上清液中HBsAg、HB eAg检测采用固相放射免疫法,按说明书所示方法进行,用γ免疫计数仪测定每孔cpm值。计 算细胞对照及每药物浓度下的cpm均值(x-)、标准差(s)和药物对抗原的半数抑制浓度( IC50)。1.2.4抗HBV活性评价采用治疗指数(TI),TI=TC50/IC50。 当TI<1时,药物为低效有毒;当1
2时,药物高效低 毒。TI越大,表明药物对HBsAg和HBeAg的抑制作用越强,细胞毒性越小。2结果天螺 多糖在体外细胞培养过程中可抑制2215细胞分泌HBsAg和HBeAg,且无细胞毒性。见Tab1。Tab1Inhititiveeffects of tianluo-polysaccharide on HBsAgand HBeAg of secretion and it′s cytotoxicity(n=4)Drugconcentration/mg·L-1HBs AgInhibitive/%IC50TIHBeAgInhibitive/%IC50TI Cellarsurvivalrate/%TC5016071.343.73.188.03 9.8>4.0297.4*8066.178.499.14042.857.1101.22036.626.31001011.03.6100*nocytotoxicity3讨论研究表明,HBV复制与共价闭合环状DNA(CCC-DNA) 分子形成、HBV-DNA负股形成和正股合成均有密切关系。而HBV基因组外侧负股上含4个 开放编码区,即外壳蛋白编码区、核心蛋白编码区、聚合酶编码区和X蛋白编码区。其中核心蛋白编码区所含的GeneC与Per-C共同编码312个氨基酸的多肽P25,后者在切去前C蛋白等之后,即形成e抗原 <4>。因此,HBeAg检测可在一定程度上反映HBV-DNA的复制情况。2215细胞系是由美国MountSinai医学中心以HBV-DNA转染人类肝癌细胞株HepG2所建立的细胞系,能有效表达 HBV复制的全部标志。因此,以2215细胞株为靶细胞进行细胞培养,观察药物对HBV复制 过程的影响可较为准确地反映药物对乙肝病毒复制过程的实际作用。本实验显示,天螺霜具有明显 体外抗HBV作用,且无细胞毒性,从而为寻找高活性天然抗病毒物质开辟了新途径,但该物质对 其它病毒的抑制作用如何以及抗病毒作用的确切机制还有待进一步研究。天螺霜抑制2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的实验研究@张超$安徽理工大学医学院!安徽淮南232001
@凌庆枝$合肥工业大学生物与食品工程学院!安徽合肥230009
@刘群红$安徽理工大学医学院!安徽淮南232001 天螺多糖;;2215细胞;; 药物作用; ; 乙型肝炎病毒<1>张超,刘群红.江西巴蜗牛生物活性成分提取及其抗乙肝病毒作用的初步研究.中国实验方剂学杂志,2002,8(3):29-30.
<2>傅希贤,张乃临,张国庆.试用2215细胞进行乙肝病毒药物实验的初步结果.中华实验和临床病毒学杂志,1992,6(2):143.
<3>周海茵,叶古祥,孙国娣,等.MTT法测定大肠癌化疗药物敏感性.现代诊断与治疗,2002,13(1):9-11.
<4>陈灏珠主编.实用内科学,第10版,北京:人民卫生出版社,1997:263.
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