洛索洛芬钠(loxoprofen sodium)是日本开发上市的非甾体抗炎药,它具有较高的抗炎、镇痛、解热作用且消化道副作 用小<1>。该药被认为是一种前体药物,在消化道吸收后迅速转变成具有生物活性的代谢物而发 挥作用。目前文献报道的液相方法操作繁琐,耗时长。本文应用LC-MS联用技术,建立了简便 灵敏的体内分析方法,为该药在人体内的药代动力学研究提供了一种可靠的检测手段。1材料与方 法1.1药品与试剂洛索洛芬钠对照品(99.8%)由福建新安药业股份有限公司提供,布洛芬 对照品(内标,99.9%)购自江苏省药品检验所。乙腈为色谱纯,购自Fisher公司;正 己烷,乙醚,盐酸均为分析纯,购自南京化学试剂一厂,实验用水为超纯水。1.2仪器日本岛津 公司2010型液相色谱-质谱联用仪,配有在线真空脱气机,LC-10AD高效液相色谱输液泵、恒温自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化(ESI)接口的四极杆质谱检测器以及LCMSsolution工作站V2.02。美国Thermo公司SPD2010型旋转蒸发干燥仪,M illi-Q纯水仪。1.3色谱条件色谱柱为DIKMA公司DiamonsilC18柱,150mm×2.1 mm,粒径5μm。流动相为0.2%醋酸铵-乙腈(25 75,v/v);流速:0.2ml·min-1,柱温40℃。1.4质谱检测参数电喷雾离子化 (ESI);离子极性:Negative;选择性离子检测(SIM):洛索洛芬m/z:245.05
-,布洛芬m/z:205.00-;雾化气流速4.5L·min-1,曲形脱溶剂装置(CDL)温度:250℃,电压-25 V;加热块(Block)温度:200℃;探针(Probe)电压4.5 kV;检测电压1.60 kV。1.5血浆样品处理取血浆0.2 ml,并精密加入内标布洛芬标准溶液20μl(50 g·ml-1),涡旋振荡10s,再加入2 mol·L-1Hcl 0.5 ml,涡旋振荡30 s;然后加入5 ml正己烷-乙醚(4 1)混合溶剂,涡旋混合1min,于3 000 r·min-1离心5 min。将上层有机相定量转移4 ml至另一试管中,50℃旋转真空干燥,完成后加入200μl乙腈,涡旋振荡2 min重新溶解,于18 000 r·min-14℃离心10 min,精密吸取5μl上清液进样分析。1.6给药剂量与方法20名健康志愿者随机分为2组,交叉口服洛索洛芬钠参比制剂和受试制剂,剂量均为60 mg,每次试验间隔2周,受试者于试验前晚8时后禁食,次日晨用200 ml温开水送服受试药物。服药4 h进相同标准餐。1.7血液标本收集与处理分别于给药前,给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h取静脉血2 ml,肝素抗凝,取血浆-30℃保存待测。1.8数据处理药代动力学参数用中国药科大学药代动 力学重点实验室编制的药动学软件BAPP2.1进行验证。2结果2.1专属性分别取20人的空白血浆0.2ml,按“血浆样品处理”项下操作,进样量5μl,得空白血浆色谱图。另取空白血浆加入适量的 洛索洛芬钠和布洛芬标准品溶液,同样方法处理后进样,从色谱图上可见洛索洛芬钠的保留时间约为2.5min,内标布洛芬的保留时间约为3.0 min(图1),在本实验条件下,空白血浆中内源性物质不干扰样品及内标物的测定。图1空白血浆、标准品和样品的色谱图A:空白血浆;B:标准品的甲醇溶液(1 g·ml-1);C:空白血浆+标准品(1 g·ml-1);D:受试者用药(洛索洛芬、布洛芬)后1.5 h血浆样品2.2标准曲线于试管精密加入不同量的洛索洛芬钠标准溶液,氮气流吹干后,分别加入0.2 ml空白血浆,涡旋振荡1 min,使成每毫升含0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g的洛索洛芬钠,按“血浆样品的处理”项下操作,每种浓度做5份样品,记录峰面积,以样品的离 子流峰面积(As)与内标的离子流峰面积(Ais)的比值(f)对浓度(C)作直线回归,得 回归方程,即为标准曲线f=0.573C+0.0138,相关系数r=0.9997(n=5 )。2.3准确度与精密度按“标准曲线制备”项下操作,配制3种浓度(0.25、1.00和10.00g·ml-1)的含药血浆,对血样分析者采用单盲法进行方法学的质量控制,以测得浓度表示,每种浓度5份样本,连续分析3 d并利用随行标准曲线求得浓度,以计算本方法的准确度与精密度(表1)。Chin J Clin Pharmacol Ther 2006 Feb;11(2)浓度/mg·L-1日内变异RSD(%)日间变异RSD(%)相对回收率(%)0.25 0.25 9.4 0.23 11.7 96.0±4.21.00 0.98 8.3 0.91 9.4 90.0±6.610.00 9.63 4.8 10.00 5.2 98.1±8.92.4回收率与稳定性按“标准曲线制备”项下操作,制成0.10、0.25、1.00、10.00 g·ml-1的样品,按“血浆样品的处理”项下操作,记录样品离子流峰面积(Ax)。另将相应 浓度的该药标准溶液直接进样,记录样品离子流峰面积(As)。上述Ax与As的比值为提取回 收率,每一浓度进行5样本分析(表2)。按“标准曲线制备”项下操作,制备0.25、1.00和10.00g·ml-1的样品,放置-80℃冰箱冷藏2周,然后37℃水浴融解,按“血浆样品的处理”项 下处理样品,测定并利用随行标准曲线求得浓度,各浓度偏差均在5%以内。表2人血浆中洛索洛芬的回收率(x±s,n=5)浓度/g·ml-1回收率(%)RSD(%)0.1083.1±4.0 10.40.25 84.5±2.8 4.91.00 81.5±4.1 2.810.00 82.2±1.6 3.52.5药代动力学结果20名健康受试者服用洛索洛芬钠受试和参比制剂(60 mg)后,依照随行标准曲线计算不同时间的血药浓度,其平均药时曲线见图2。主要药代动力学参数用BAPP 2.1生物等效性计算程序处理,并进行相应的统计分析。其主要药代动力学参数见表3。图2 20名健康志愿者单剂量口服受试制剂和参比制剂60mg后的血药浓度-时间曲线表3 20名健康志愿者单剂量口服受试制剂和参比制剂的药代动力学参数(x±s,n=20)药动学参数受试制剂参比制剂AUC0-10/μg·ml-1·h 11.65±13.75 11.19±1.83AUC0-∞/μg·ml-1·h 12.04±14.17 11.64±1.89Cmax/μg·ml-17.17±1.63 6.94±1.33Tmax/h 0.46±0.23 0.46±0.28t1/2/h 2.01±0.20 2.12±0.23MRT/h 2.44±0.33 2.41±0.392.6相对生物利用度根据公式:相对生物利用度=AUC0-∞(受试制剂) /AUC0-∞(参比制剂)×100%,计算洛索洛芬钠受试制剂的相对生物利用度为(105 .3±11.5)%。2.7生物等效性分析用BAPP2.1程序对受试制剂与参比制剂的Cm ax、AUC0-10、AUC0-∞经对数转换后进行方差分析和双单侧检验、90%可信限考 察,lnCmaxl、nAUC0-10的90%双单侧检验结果分别为98.01%~110. 01%,100.3%~109.45%。结果表明,两制剂生物等效。Tmax经非参数法检验 (Wilcoxon符号秩检),结果为:S=60>S0.05(15)=25,两者无显著性 差别(P>0.05)。3讨论文献报道<2>用高效液相色谱紫外检测法进行该药的测定,整个分析时间长达30min左右,文献报道<3>的高效液相荧光法需进行柱前衍生化反应,试剂昂贵操作繁琐,反应时间达5 h,且分析时间也为30 min,而本方法分析时间仅需6 min。文献报道<4,5>的高效液相法分析时间为9 min左右,其使用固相萃取法提取,材料昂贵;1 ml血样浓缩10倍后最低定量限为50 ng。而本文采用的LC-MS方法血浆样品用量仅为0.2 ml,采用液-液萃取,在样品不浓缩的情况下最低定量限为100 ng,灵敏度高于文献报道的高效液相方法。通过优化条件,该方法的测定灵敏度可达10 ng。综上所述,本文报道的方法灵敏快速,操作简单,成本低廉。在生物利用度试验中,由于本方法使用的血浆量仅为0.2 ml,受试者顺应性良好;得益于本方法较高的灵敏度,我们对血浆中洛索洛芬浓度的监测达到了10 h,明显长于国内外文献中报道的6 h。20名健康受试者单剂量口服60 mg洛索洛芬钠受试和参比制剂后,两种制剂在人体内的药代动力学参数基本相似,血浆中洛索洛芬 的血药浓度及主要药代动力学参数与国内外文献报道<2,4>的数据基本一致。该药具有旋光性 ,不同公司的色谱柱对洛索洛芬钠的光学对映体有不同的分离能力,若能够使用手性色谱柱,经过 一定的调整,该法可很方便的应用于此药物的手性分析。HPLC-MS法快速测定人血浆中洛索洛芬钠的浓度及其药代动力学研究@李昊$中国药科大学药代动力学重点实验室!南京210038江苏
@孙建国$中国药科大学药代动力学重点实验室!南京210038江苏
@王广基$中国药科大学药代动力学重点实验室!南京210038江苏
@姜希凌$中国药科大学药代动力学重点实验室!南京210038江苏
@谢媛媛$中国药科大学药代动力学重点实验室!南京210038江苏
@李鹏$中国药科大学药代动力学重点实验室!南京210038江苏目的:建立一种快速测定人血浆中洛索洛芬钠含量的方法,并应用于测定洛索洛芬
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