甘草G lycy rrh iza ura lensis F isch.中的有效成分很多,其中主要有三萜类化合物甘草酸和黄酮类化合物。甘草酸是一种重要 的精细化工产品,在医药、食品和化妆品等方面有着广泛的应用<1>,甘草黄酮也是一类生物活 性较强的成分,有抗溃疡、抗菌、抗炎、解痉、调血脂、镇痛等作用<2>。目前,工业上还主要 以生产甘草酸为主,在排出的固体甘草废渣中,仍含有大量的甘草黄酮和部分甘草酸。而在文献报 道的甘草黄酮提取工艺中也没有利用甘草酸<3>,造成了资源的浪费。实际上,可以同时从甘草 中提取甘草酸和甘草黄酮类化合物,惠寿年等<4>提出采用水煮提法对甘草进行深加工,在提取甘草酸的同时提取甘草黄酮,但一次提取的时间为2h,能源利用率较低。微波法是一种较新的方法,Pan等<5>利用微波提取技术采用氨性乙醇对 甘草中的甘草酸进行提取,甘草酸的提取率为2.58%,并证实了微波提取法与热回流法、索式 提取法相比,具有提取高效、快速,节省时间、溶剂和能源等优点。本研究采用微波技术,选择合 适的溶剂和提取方法同时从甘草中提取甘草酸和甘草黄酮。1仪器与材料家用微波炉(顺德市美的微波炉制造有限公司)实验室改装<5>,台式离心机(上海安亭科学仪器厂),高效液相色谱(美国Alltech),紫外-可见分光光度计(Cary 100)。甘草购自北京同仁堂医药股份有限公司,经实验室加工制成3种原料:粉碎机粉碎得到甘 草粗粉(20~60目);甘草粗粉经研磨过60目筛,得到甘草细粉;未能过筛的甘草皮、纤维 等材料反复研磨得到甘草边角料(60目)。甘草酸单铵盐对照品(北京联合大学霍清赠,质量分 数≥98%),柚皮苷对照品(天津尖峰天然产物公司,质量分数98%),试剂均为AR纯。2方法2.1微波法提取甘草酸和甘草黄酮:称3g甘草细粉(或粗粉或边角料),加入提取溶剂30 mL,进行微波提取,微波辐照时间为4 m in,提取温度在80℃左右,离心分离得到上清液即为提取液。2.2甘草酸的HPLC分析条件<6>及标准曲线制备:ODS C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:乙腈-3%醋酸(41∶59);体积流量:1 mL/m in;检测波长:248 nm;进样量:20μL,甘草酸保留时间为6.7 m in。配制1 m g/mL甘草酸单铵盐对照品溶液,分别取出2、4、6、8 mL,定容于10 mL量瓶中,进行HPLC分析。以甘草酸峰面积对甘草酸质量浓度绘制标准曲线,标准曲线的方程为Y=6×106X-1 027.5,r=0.996 4,线性范围为0.2~1.0m g/mL。2.3甘草黄酮的分析方法及标准曲线制备:根据文献报道<7>的甘草黄酮分析方法加以改进。以1 m g/mL柚皮苷作为对照品,用微量进样器精密吸取对照品溶液10、20、40、60、80、100、120、140μL于10mL量瓶中,分别加入1 mL无水乙醇,0.5 mL 10%KOH,室温放置5 m in后用无水乙醇定容,在425nm检测波长下,以乙醇作为空白进行吸光度值的测定。以测定结果计算得到甘草黄酮吸光度值对质量浓度的标准曲线方程Y=1.927 3 X-0.012 6,r=0.996 3,线性范围为10~140μg/μL。将样品稀释后取0.5 mL稀释液,加入1 mL无水乙醇,再加入0.5 mL 10%KOH溶液,摇匀,室温放置5 m in,定容于10 mL量瓶中。再取稀释样品0.5 mL,直接用无水乙醇定容,作为空白对照,在425 nm波长下测定吸光度值,分析甘草黄酮的质量浓度。2.4甘草酸与甘草黄酮提取率:按下式计算 。甘草酸提取率=提取液中甘草酸的质量/提取用甘草的质量×100%甘草黄酮提取率=提取液 中甘草黄酮的质量/提取用甘草质量×100%3结果与讨论3.1提取溶剂的组成对提取液中甘 草酸和甘草黄酮提取率的影响:甘草酸易溶于乙醇溶液,多数黄酮类化合物也易溶于乙醇,因此乙 醇-水系统可以同时满足甘草酸和甘草黄酮的提取需要,由图1看出,当乙醇体积分数为60%时 ,甘草酸的提取率最高;乙醇体积分数为80%时,甘草黄酮的提取率最高。此外,在乙醇低的体 积分数下,甘草中的可溶性蛋白、淀粉糖类等成分都存在于提取液中,为后续的离心、滤过以及产 品的分离纯化带来很大的困难,因此,甘草有效成分提取溶剂乙醇的体积分数应该控制在60%~80%比较合适。图1乙醇体积分数对甘草酸(A)和甘草黄酮(B)提取率的影响Fig.1 E ffect of ethano l concen tration on extractionrate of g lycyrrh iz ic ac id(A)and f lavno ids(B)甘草酸的铵盐易溶于水,分别采用60%乙醇和60%氨性醇30 mL对3 g甘草粗粉,微波中高火4m in进行提取,结果甘草酸和甘草黄酮的提取率分别为2.95%、2.74%、2.58%、1. 89%。在乙醇水溶液中加入氨水并没有使甘草酸的提取率有显著提高,而且浸出了大量的色素类 物质,分析是由于甘草酸易溶于高体积分数的乙醇溶液,加入氨水对甘草酸的提取并没有促进作用 。此外,甘草黄酮的提取率大大的降低了,可能是由于碱性条件不利于甘草黄酮的提取。因此为了 能同时满足甘草酸和甘草黄酮的提取,可以选择60%~80%乙醇溶液作为提取溶剂,而本实验 中最终选择的提取溶剂为70%乙醇水溶液,二次提取甘草酸的提取率为2.74%,甘草黄酮的 提取率为2.77%。3.2微波加热时间对甘草酸和甘草黄酮提取率的影响:见图2。对于两种粒度的甘草,甘草酸和甘草黄酮的提取率均随微波辐照时间的增加而提高,3g甘草,微波辐射2 m in,甘草酸和甘草黄酮的提取率就已经趋于平稳,随时间的增加,提取率上升缓慢。可见微波作用集中,实验选择的微波辐射时间为2 m in。1-细粉中甘草酸2-粗粉中甘草酸3-细粉中甘草黄酮4-粗粉中甘草黄酮1-g lycyrrh izic acid in 60 m esh pow der 2-g lycyrrh izicacid in large p iece 3-flavno ids in 60 m esh pow der4-flavno ids in large p iece图2微波辐照时间对甘草酸和甘草黄酮提取率的影响F ig.2 E ffect of M AE tim e on extractionof g lycyrrh iz ic ac id,and f lavno ids3.3微波功率对提取率的影响:用30 mL 70%乙醇溶液提取3 g甘草细粉,微波辐照4 m in提取1次,甘草酸与甘草黄酮的提取率见表1。可以看出,甘草酸和甘草黄酮的提取率均随微波 功率的提高而增加,若要达到相应的提取率,采用中火加热时需要较长的微波辐照时间。采用高火 加热,十分容易暴沸,严重影响提取效果,而且,高火加热与中高火加热产品的提取率相比,并没有显著的提高,因此提取时的微波功率选择为中高火档。表1微波功率对提取率的影响Table 1 E ffect of m icrowave power on extracting rate微波功率甘草酸提取率/%甘草黄酮提取率/%中火1.89 1.87中高火2.31 2.10高火2.38 2.193.4提取溶剂与甘草的液固比对甘草酸和甘草黄酮提取率的影响:见表2。可见,甘草酸 的提取率随液固比的增加而提高,但在相同的能量供给和微波时间作用下,当液固比大于10时, 甘草酸提取率基本保持不变,而由于甘草黄酮的提取率有下降的趋势,综合考虑选择液固比10∶ 1。3.5甘草选料粒度的影响及微波提取次数的确定:见表3。甘草粒度变小,甘草酸和甘草黄 酮的提取率会有所提高,尤其是对于1次提取而言,甘草的粒度是影响提取率的重要因素,且两次提取基本上可以表2提取溶剂与甘草的液固比对提取率的影响Table 2 E ffect of liqu id/so lid ratio on extracting rate甘草质量:提取溶剂体积/(g·mL-1)甘草酸提取率/%甘草黄酮提取率/%6∶1 2.50 2.078∶1 2.75 2.2610∶1 2.95 2.7415∶1 2.96 2.6620∶1 2.99 2.59表3不同甘草材料3次提取的提取率结果Tab le 3 R esu lts of extracting rate in threetim es for d ifferen t m ater ia ls甘草材料甘草酸提取率/%1次2次3次总提取率甘草黄酮提取率/%1次2次3次总提取率甘草细粉2.38 0.68 0.12 3.18 2.26 0.54 0 2.80甘草粗粉1.58 0.99 0.45 3.02 1.64 0.66 0.02 2.32边角料细粉0.86 0.79 0.27 1.93 1.00 0.20 0 1.20达到一个相当高的提取率水平,可能是由于粒度变小,比表面积增大,植物细胞、组织受破 坏程度较大,从而利于有效成分的扩散。边角料细粉主要为纤维类物质,有效成分的质量分数较低 ,所以提取率很低。而对于甘草粗粉,采用3次提取也可以达到与使用细粉相当的水平,这也说明 了微波法具有很高的传质效应,因此也可以采用甘草粗粉作为原料,连续3次提取甘草中的有效成分。3.6微波工艺与传统热回流法的比较:根据实验结果,采用70%乙醇对10g甘草细粉进行提取,液固比为10∶1,微波功率为中高火,提取2次;采用传统的热回流工艺对10 g甘草细粉进行提取,提取溶剂为70%乙醇100 mL,提取温度控制为85~90℃,提取两次,结果见表4。微波提取6 m in与热回
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