黄柏为常用中药,系芸香科植物黄皮树P hel-lod end ron ch inense Schneid.及黄柏树P.amurenseRupr.除去栓皮的干燥树皮,前者习惯称“川 黄柏”,后者习惯称“关黄柏”。黄柏性味苦寒,具有清热燥湿、泻火解毒、退虚热等功效。主要 含有生物碱,如小檗碱、药根碱、木兰花碱等。另含黄柏酮、白鲜交酯、黄柏内酯等。其中,黄柏 内酯具有降血糖<1>、驱虫、抗溃疡<2>的作用,可作为黄柏及其制剂的指标性成分之一。一 直以来,《中国药典》及各种文献中大多单独以小檗碱作为黄柏药材及制剂定性定量的指标性成分 ,然而,小檗碱存在于黄连、三颗针、功劳木多种植物中,其专属性较差,黄柏内酯作为黄柏药材 及其制剂的指标性成分更加具有科学性。本实验建立了黄柏药材中黄柏内酯的测定方法,该方法操 作简便、准确,重现性好,为改善黄柏中的指标性成分的专属问题提供参考。1仪器与试药1.1仪器:RE—52A薄膜旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),Brucker AM—500型核磁共振仪,APEXⅡFT—ICR型质谱仪,SHZ—3型水循环真空泵(河南 巩义市英峪电子仪器厂),KQ—100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),惠普HP 1050高效液相色谱仪。1.2试药:柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂);水为重 蒸水,乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯;显色剂为对二甲基氨基苯甲醛;关黄柏1于2003年采自吉林,经本校生药系阎玉凝教授鉴定为黄柏树Phellod end ron amurense Rupr.干燥树皮;关黄柏2、川黄柏、山黄柏来自中药学院生药系标本馆;黄柏内酯对照品为自 制,质量分数>98%。2方法与结果2.1黄柏内酯的提取分离与结构鉴定:将关黄柏1依次用 石油醚、醋酸乙酯提取。将醋酸乙酯提取物进行硅胶柱色谱分离,以氯仿-醋酸乙酯(50∶1~ 8∶1)进行梯度洗脱,将氯仿-醋酸乙酯(10∶1)部分进行反复柱色谱分离,得到白色针状结晶(CHCl3-M eOH)。经结构鉴定为黄柏内酯(obacu lactone)<3>。2.2色谱条件:D iam onsil-C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:乙腈-水-磷酸(50∶50∶0.2),体积流量:1.0 mL/m in,柱温:室温,检测波长210 nm。在此条件下,样品中黄柏内酯与相邻成分达到良好基线分离,见图1。A-黄柏内酯对照品B-关黄柏1 C-关黄柏2 D-川黄柏E-山黄柏A-obacu lactone B-P.am urense 1 C-P.am urense 2 D-P.ch inense S E-P.am urense producted in H ebe i and H enan图1对照品和样品HPLC色谱F ig.1 HPLC Chrom atogram s of reference substance and sam p les2.3对照品溶液的制备:取黄柏内酯对照品适量,精密称定,加乙腈溶液制成0.206 m g/mL的对照品溶液。2.4供试品溶液的制备:取关黄柏1粗粉(过40目筛)1 g,精密称定,置索氏提取器中,以石油醚加热回流提取3 h,弃去石油醚提取液;残渣加氯仿加热回流提取5 h,提取液回收氯仿,用乙腈转溶至10mL量瓶中,定容,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤 过,即得。2.5线性关系考察:分别取上述对照品溶液3、6、9、12、15μL,注入液相色谱仪,以黄柏内酯的峰面积为纵坐标、进样量为横坐标,得到回归方程:Y=719.83X+80.5,r=0.999 4,结果表明黄柏内酯进样量在0.618~3.090μg时线性关系良好。2.6精密度试验:精密吸取黄柏内酯对照品溶液(0.206 m g/mL)12μL,连续进样5次,计算得峰面积的RSD为0.82%。2.7稳定性试验:取同一关黄柏1供试品溶液,分别于0、2、4、6、8 h进样,每次20μL,计算得峰面积的RSD为0.75%。结果表明,供试品溶液中的黄柏内酯至少在8 h内稳定。2.8重现性试验:按照前述供试品溶液制备方法,精密称取同一批关黄柏1,分别制备 5份供试品溶液,每次进样20μL,按上述色谱条件测定黄柏内酯的质量分数,结果平均为0.112%,RSD=1.26%。2.9加样回收率试验:称取0.5g样品5份,分别加入黄柏内酯对照品0.618 m g,依供试品溶液制备方法操作,结果平均回收率为96.43%,RSD=1.15%。2.10 样品测定:按照关黄柏1的供试品溶液制备方法,分别制备关黄柏2、川黄柏和山黄柏样品溶液, 在前述色谱条件下,每次进样20μL,样品获得良好分离,测得各样品中黄柏内酯,结果见表1。表1样品的测定结果(n=5)Table 1 D eterm ination of sam p les(n=5)样品黄柏内酯/%关黄柏2 0.269川黄柏0.154山黄柏0.0573讨论3.1流动相系统的选择:黄柏内酯与黄柏酮 均属于柠檬苦素类化合物,参考柑桔中黄柏酮的测定方法<4>:流动相条件为乙腈-水-三氟乙 酸(20∶80∶0.03),在本试验的色谱条件下样品分离度不好,经过筛选最终确定了流动 相为乙腈-水-磷酸(50∶50∶0.2),该条件能够保障黄柏内酯在反相柱上达到良好的分 离。3.2供试品溶液制备的条件:选择比较了甲醇、氯仿、醋酸乙酯3种提取溶剂,并考察了回流提取时间,最终确定以氯仿回流提取5h。3.3由于样品来源有限,测定份数较少,如果确定将黄柏内酯作为黄柏的指标性成分之一,还 需要进一步的积累数据。RP-HPLC法测定黄柏中黄柏内酯@马学敏$北京中医药大学!北京100102,北京大学,北京100083
@王力生$北京中医药大学!北京100102
@赵巍$北京中医药大学!北京100102
@郭亚健$北京中医药大学!北京100102
@郭树仁$北京大学!北京100083<1>Editorial Office of National Chinese Herbal Medicine Collec-tion.Collection of National Chinese Herbal Medicine(全国中草药汇编)
.Beijing:People’s Medical PublishingHouse,1975.
<2>Information Center of Chinese Herbal Medicine,State Phar-maceutical Administration of China.Handbook of ActiveConstituents in Phytomedicine(植物有效成分手册).Beijing:People’s Medical Publishing House,1986.
<3>Yu D Q,Yang J S,Xie J X.Handbook of AnalysisChemistry(分析化学手册).Beijing:Chemical Industry Press,1999.
<4>Tian Q C,Dai J,Ding X L.Screening for limonoid gluco-sides in Citrus grandis L.Osbeck by HPLC-EI/MS.Chin J Chromatogr(色谱),2000,18(4):291.al Chinese Herbal Medicine Collec-tion.Collection of National Chinese Herbal Medicine(全国中草药汇编).Beijing:People’s Medical PublishingHouse,1975.
<2>Information Center of Chinese Herbal Medicine,State Phar-maceutical Administration of China.Handbook of ActiveConstituents in Phytomedicine(植物有效成分手册).Beijing:People’s Medical Publishing House,1986.
<3>Yu D Q,Yang J S,Xie J X.Handbook of AnalysisChemistry(分析化学手册).Beijing:Chemical Industry Press,1999.
<4>Tian Q C,Dai J,Ding X L.Screening for limonoid gluco-sides in Citrus grandis L.Osbeck by HPLC-EI/MS.Chin J Chromatogr(色谱),2000,18(4):291.
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