甘草是我国常用的中草药品种之一,除主要医药用外,还广泛地应用于烟草、食品、酿造以及化妆品工业等领域<1>。甘草的主要有效成分为甘草酸(glycyrrhizic acid)或甘草甜素(glycyrrhizin)及甘草次酸(glycyrrhetinic acid)等三萜类化合物、甘草黄酮类化合物以及甘草多糖等<2>。药理研究表明,甘草酸及甘 草次酸具有解毒、消炎、镇痛、抗肿瘤的作用,近年来,还用于防治病毒性肝炎、癌症以及艾滋病 等<3>。甘草酸及甘草次酸的提取和含量的测定在甘草研究中具有举足轻重的地位。我国虽是甘 草生产和出口的大国,但对甘草主要有效成分甘草酸的生物合成、作用机制、精制加工和综合利用 的深入研究还落后于日本等国。受技术条件和工艺限制,应用传统方法提取的甘草酸粗品的纯度低 ,在国际市场上的价格低,并且提取效率也低,对甘草资源的利用不充分,影响了我国甘草产业的 发展。目前,国内外涌现出许多先进的提取技术(如超临界流体提取法、微波辅助提取法等),以 及高效灵敏的测定方法(如高效液相色谱、毛细管电泳<4>等),对这一领域研究的一些进展进 行简单的概括,希望有助于我国甘草的研究和利用开发。1甘草酸的提取方法1·1提取溶剂的选 择甘草酸为三萜皂苷,在甘草中以钠盐或钾盐的形式存在,水解生成甘草次酸和2分子的葡萄糖醛 酸。甘草酸易溶于热水和热稀乙醇,不溶于无水乙醇和乙醚,遇酸沉淀<5>。根据甘草酸和甘草 次酸的理化性质和实际工艺要求,提取的溶剂主要有水、稀氨水、稀醇和氨性醇溶液<6,7>。 水提法操作是最常用的方法,溶剂的成本相对较低,对环境安全,操作较为简单,适于工业化生产 和甘草酸粗品的提取。但该方法由于提取液富含糖及蛋白质等杂质,易被细菌或真菌污染而发霉, 由于富含蛋白质等高分子成分,黏度大,且水的沸点高(100℃),浓缩较费时间,收率比较低 。提取溶剂若采用稀氨水(0·5%~5%),则可与甘草酸形成铵盐而增加其水溶性,使提取效 率提高,但提取过程中会有氨气逸出,易造成环境污染。稀醇(甲醇或乙醇50%~70%)溶液 对甘草酸的溶解性较好,对植物细胞组织的穿透性也较强,多糖、蛋白质等在醇溶液中易产生沉淀 ,因此提取液的杂质较少,提取效率较高,不易发霉,但成本相对较高。结合氨水提取和稀醇提取 的特点,采用氨性醇提取甘草酸的效果最佳,收率最高,可比水提法提高3倍以上,从而节约资源 、降低成本,并且避免了糖类、淀粉等水溶性杂质的混入,便于精制,适于实验室研究的定量测定 <8,9>。但不同研究者由于研究的目的不同,氨醇的应用比例并不一致。如黄维安等认为采用 含0·3%氨的60%乙醇提取较好<10>;潘学军等采用60%乙醇+1%氨水+水<9>; 王巧娥等认为含10%乙醇的0·5%氨水提取率最高<11>。章玉华等<8>比较了各种溶剂 提取甘草酸的优缺点,见表1。在甘草酸粗提的众多方法中,先加酸水提法和稀氨水提取法比较适 合工业生产,而氨性无水乙醇提取法较适合实验室提取高纯度甘草酸。1·2甘草酸粗提液的制备 方法1·2·1传统提取方法从甘草及其制品中提取甘草酸的传统方法包括室温冷浸法、渗漉法、 煎煮和热回流法以及索氏(Soxhlet)提取法。室温冷浸法是在室温条件下,将过一定目数 筛的甘草粉末直接加入到适当容器中,加入适当比例的水、氨水或醇等溶剂浸提,其提取的效率较低,时间相对较长;渗漉法需要使表1甘草酸粗品提取方法对比提取方法得率/%纯度/%优点缺点先加醇水提法3.6575粗品纯度高得率低,工艺复杂先加酸水提法8.27 53工艺简单、成本低粗品纯度不高稀氨水法10.21 50得率高,工艺简单,成本低粗品纯度不高,氨气污染无水乙醇法7.51 71粗品纯度高成本高,时间长氨性无水乙醇法10.75 65得率高,粗品纯度高成本高,时间长,氨气污染氨性乙醇溶液法30.39 20得率高粗品纯度低,时间长,污染用特制的渗漉设备,不断加入溶剂,使与渗出液一直保持相当 的浓度差,提取效率较冷浸法高,但与冷浸法一样提取时间较长,溶剂消耗量较大;煎煮和热回流 法是通过加热处理,增加甘草酸的溶解度和加快溶出速度,热回流法避免了乙醇等低沸点溶剂的挥 发损失,提取效率较高;索氏(Soxhlet)提取法又称连续回流提取法,其利用索氏提取器 对甘草粉末进行提取,加热蒸发的溶剂经冷凝后又回到样品管中,经约10个循环后,基本可将甘 草中的甘草酸提取完全,提取效率较高,同时节省了溶剂,但时间相对较长。1·2·2超声强化提取法(ultrasoundwave extraction,UE)超声波的频率为20 kHz,通过超声波的空化作用产生极大的压力,造成细胞壁的破裂,并在瞬间完成,同时产生的振 动作用一起强化了细胞内物质的释放、扩展和溶解,加速了样品中组分的溶出,提取效率较高,时 间较短。赵茜等<12>以氨水为溶剂研究了超声介入强化提取甘草酸的作用效果,通过对施加超 声场的功率、温度、浸渍时间、pH以及搅拌速率等参数进行了研究,认为与未施加超声场的传统 方法相比,超声辅助提取可显著缩短提取时间,并获得较高的提取率。1·2·3微波辅助提取法(microwave-assistedextraction,MAE)微波是频率介于300 MHz和300 GHz之间的电磁波,可促使细胞内的介质转动能级跃迁,加剧热运动,尤其是水分子,吸收微波能 量,使胞内温度迅速上升,液态水气化产生的压力将细胞壁和细胞膜冲破,形成孔洞和裂纹,使胞 外的溶剂容易进入细胞内,溶出胞内有效成分。其穿透力强、选择性高、加热效率高,操作简便、安全、快速、节能。潘学军等研究了微波辅助提取甘草酸的条件<9>,发现当微波提取4~5min,乙醇含量为50%~60%,氨水含量为1%~2%,液固比为10∶1(mL·g-1) 时,甘草酸的回收率与热回流法、索氏(Soxhlet)提取法、室温提取法等传统提取方法相 当,但MAE比传统方法更节约时间和溶剂,效率更高。1·2·4超临界流体提取法(supercriticalfluid extraction,SFE)原理是通过调节压力和温度,使物质的气相和液相消失,形成超临 界流体,溶解力与液体相似,但扩散系数接近气体,因此,可对中草药中的成分进行选择性提取, 提取的效率较高,提取液的杂质少,提取时间较短。通常使用的超临界流体为CO2,其临界温度 为31·06℃,不需要加热就能将溶质和溶剂分开,无毒、高效、价廉,并具有灭菌功能。李巧 玲等<13>研究了超临界流体技术萃取甘草酸的各种因素,并与冷浸法、热提法、超声波法提取 甘草酸作了比较研究,结果表明SFE法的萃取率高于上述3种方法,而萃取周期大大缩短,并且 节省提取溶剂;付玉杰等<14>通过调节温度、压力、CO2流速以及夹带剂与甘草粉末的液固 比研究了甘草酸水解产物甘草次酸的超临界CO2提取的工艺。1·3纯化甘草酸的方法由于应用 上述方法提取的甘草酸粗提液中除含有甘草酸外,还含有许多杂质,如还原糖、胶质、蛋白质、淀 粉、黄酮类等物质,要获得甘草酸纯品需要进一步除去这些杂质。目前,精制甘草酸的方法主要包 括酸沉反复结晶、双水相萃取、树脂吸附、超滤膜分离等<15>。1·3·1反复结晶法甘草酸 粗提液加酸沉淀,再经乙醇或丙酮溶提,氨化成盐析出,再经活性炭脱色,反复结晶得到甘草酸纯品。1·3·2双水相萃取技术(aqueoustwo phase extraction,ATPE)是利用被提取物质在不同的两相系统间分配行为的差异进行分离 。与传统水煎醇沉相比,ATPE操作方便,条件温和,时间短,易于工程放大和连续操作。霍清 等<16>通过对6种双水相体系中不同种类盐分相能力及不同种类有机溶剂的分相情况进行研究 ,确定了萃取甘草酸的最佳双水相体系为乙醇/磷酸氢二钾双水相体系。此体系收率可达98·3 %,并且溶剂价廉、低毒、易挥发、易回收,操作简便,适于从甘草提取液中制备甘草酸单铵盐。 林金清等<17>采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取甘草酸钾液也取得了较好的收率。1·3·3吸附树脂法(absorptionresin,AR)包括离子交换树脂和大孔吸附树脂2种方法。其原理是利用树脂对甘草酸的选择 性离子交换或树脂对甘草酸及杂质的吸附能力差异,从甘草酸粗提液中选择性吸附甘草酸,然后用 稀醇溶液从树脂柱中洗脱下来,从而分离纯化甘草酸。由于离子交换树脂处理量小,需引入可进行 交换的酸性或碱性基团,提取效率较低。潘福生<18>等把从甘草中提取所得甘草酸粗制品制成 的单铵盐吸附在粉状聚酰胺上,先洗脱甘草酸单铵盐以外的杂质,再用极性溶剂洗脱甘草酸单铵盐 浓缩,再通过732强酸型阳离子交换树脂脱铵,从而制得甘草酸(纯度可达99·5%~100 %),该方法较为繁琐,但可作为生产高纯度甘草酸的优选方法。从20世纪80年代开始,日本 开始使用大孔树脂分离纯化甘草酸,国内也对大孔树脂吸附甘草酸进行了大量研究,表明其吸附量 大,分离效果较好,提取效率较高,精制的甘草酸纯度较高,且树脂的再生容易。刘倩<19>等考察了4种大孔树脂后,优选AB-8树脂进行甘草酸的分离实验,结果表明,在流速1mL·min-1,pH 6·4~7·4,原液含量10 mg·mL-1上柱条件下AB-8树脂对甘草酸的吸附量最大,可达120 mg·mL-1,洗脱比较容易,分离效果好,纯度可达95%以上。1·3·4超滤膜分离法(ultrafiltration membrane separation,UMS)其原理是以压力为推动力实现溶质与溶剂的分离,在常温下粗提液 经过超滤膜,可将还原糖、蛋白、淀粉等大分子物质除去,然后对超滤液中的甘草酸进行沉淀或吸 附纯化。该方法操作简单、无相变、能耗低,不需消耗过多的各种试剂和溶剂,提高了甘草酸的提取率。马明等<20>以中空纤维滤
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