土鳖虫和水蛭均是传统的活血化瘀中药,始载于《神农本草经》。土鳖虫具有破瘀血、续筋骨折伤、 瘀血经闭、癥瘕痞块;水蛭有破血、逐瘀、通经的功能,历来用于治疗症瘕、痞块、血瘀闭经、跌 打损伤<1>。对水蛭的活性成分报道较多,大致可分为两大类:一类是直接作用于凝血系统的成 分,包括凝血酶抑制剂,以及其它抑制血液凝固的物质,这或许就是水蛭活血化瘀的物质基础;二 类是其它蛋白酶抑制剂及其它活性成分<2>。土鳖虫的活性成分研究较少,药理研究报道其提取 液在家兔体内外均能使血浆KPTT,PT及TT延长,其作用随土鳖虫提取液浓度的增加而增强 ,抗凝活性不依赖于AT-III。从而推测是对凝血酶发挥的直接作用<3>。本实验对土鳖虫 的水提液进行了抗凝血酶活性研究,并与日本医蛭的抗凝血酶活性进行了比较。1材料1.1药材
土鳖虫,鲜品购于江苏省常州市奔牛镇东桥村土元养殖总场,干品购于江苏省中西医结合医院药材科,经本研究室鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖(EupolyphagasinensisW alker)的鲜或干燥雌体;日本医蛭,鲜品购于江苏省宿迁保安养蛭场,干品为鲜品用钓鱼线上经太阳直接晒干而成,经本研究室鉴定为日本医蛭HirudonipponiaW h itm an。1.2试剂凝血酶,常州生化千红制药有限公司,使用前以蒸馏水溶解,配成浓度为(0.1 ATUμ/1(NIH单位)的溶液;牛纤维蛋白原(Mp B iomd icals Ins9001-32-5)2方法2.1干品试液制备称取土鳖虫和日本医蛭干品细粉(40目)2g,加8倍量蒸馏水浸泡1 h,置研钵中研磨成匀浆,4℃冷浸提取,12 h后,15 000 r/m in离心15 m in,取上清,沉淀再用7倍量蒸馏水浸提8 h,同法离心,与上述上清合并,浓缩定容至0.076 g(生药)/m l,置4℃保存备用。2.2鲜品试液制备称取土鳖虫和日本医蛭鲜品各20 g,用蒸馏水洗去泥沙,加6倍量蒸馏水,高速组织捣碎,置4℃冰箱浸提过夜,15 000 r/m in离心15 m in,取上清,沉淀再用6倍量浸泡提8h,离心,与上述上清合并,置4℃保存备用。2.3抗凝血酶成分的对热稳定性量取土鳖虫和日本医蛭鲜品提取液各2 m l分别于小试管中,置沸水浴加热5 m in,冷却补足蒸发失去的水分后12 000 r/m in离心15 m in,取上清备用。2.4活性测定方法M arkwartdt凝血酶直接滴定法<4>略作改动。精密量取样品液100μ1,置几只小试管(10 mm×100 mm)中,加入含0.5%(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨苓甲烷盐酸溶液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25 m l与0.1 mol/L盐酸溶液约40 m l,加水至100 m l,调pH值至7.4)200μl,摇匀,置恒温水浴(37±0.5)℃中缓缓滴加凝血酶溶液(每分钟5μl边滴加边轻轻摇匀)至凝固<凝血酶溶液的浓度,将凝血酶溶液配成以20 NIH/m l为基准浓度的一系列浓度梯度(10×20,5×20,3×20,2×20,1/2×20,1 /4×20,1/10×20,……),使用不同浓度的凝血酶溶液来滴定血纤维蛋白原和待测水 蛭提取物(土鳖虫提取物)的混合溶液,从高浓度到低浓度的凝血酶逐步缩小水蛭提取物(土鳖虫 提取物)的活性范围,然后再精确滴定>。记录消耗凝血酶溶液的体积,中和一个单位的凝血的量 ,为一个抗凝血酶活性单位。根据消耗凝血酶的量,计算出每克生药的抗凝血酶活性。每个样品测 定3次。3结果3.1抗凝血酶活性土鳖虫和日本医蛭水提物的抗凝血酶活性测定结果见表1。用 凝血酶直接滴定法,测出土鳖虫有抗凝血酶作用,单从抗凝血酶活性来看,土鳖虫的抗凝活性与日 本医蛭处于同一数量级,说明土鳖虫与日本医蛭有相当的抗凝活性。结果还显示土鳖虫干燥后其抗 凝活性变化性不大,而日本医蛭干燥后活性降低了1倍。3.2抗凝血酶成分的对热稳定性结果见 表2。由加热结果看出,土鳖虫的抗凝成分对热不稳定,加热使其活性快速损失,而日本医蛭的抗凝活性成分对热较稳定,100℃加热5m in对其活性几乎没有影响。说明土鳖虫的抗凝活性成分与日本医蛭的抗凝活性成分有差异。表1土 鳖虫和日本医蛭水提物抗凝血酶活性测定结果样品样品浓度*C/g生药·m-l1
凝血酶**消耗量C/u抗凝活性***C/ATU·(g生药)-1土鳖虫鲜品0.1140.65 39.4土鳖虫干品0.067 0.45 37.5日本医蛭鲜品0.047 0.42 46.8日本医蛭干品0.067 0.35 22.5蒸馏水对照0 0.20 0 n=3;*土鳖虫2.3 kg鲜品可晒1 kg干品;日本医蛭5.3 kg鲜品可晒1kg干品。鲜品的生药以干品计;**测定0.1 m l样品时,加入凝血酶的单位数;***每克生药的抗凝血酶活性:ATU/g(生药)=(U1-U0)×10×v/w;式中:U1为0.1 m l样品溶液消耗血酶单位数;U0为0.1 m l对照品消耗凝血酶的单位数;v是提取液总体积(m l);w是样品重量(g)表2加热对土鳖虫和日本医蛭抗凝活性的影响样品样品浓度*C/g生药 ·m-l1凝血酶**消耗量C/u抗凝活性***C/ATU·(g生药)-1土鳖虫免加热0.1140.65 39.4土鳖虫加热0.114 0.22 3日本医蛭免加热0.047 0.42 46.8日本医蛭加热0.047 0.4 42.6蒸馏水对照0 0.2 0计算方法同表1之表注;n=34讨论土鳖虫和水蛭均为破血类活血化瘀药<1>,在治疗心脑血 管疾病方面具有相同的疗效,对土鳖虫的抗凝血酶活性成分研究具有重大的意义。目前吸血水蛭的 养殖还未能完全解决,吸血水蛭和市场供不应求,水蛭价格连年攀升。而土鳖虫的饲养非常容易, 加之土鳖虫除含有溶解纤维蛋白的酶类外<5>,还含有抗凝血酶活性物质,其应用前景应该比水 蛭更为广阔。土鳖虫与日本医蛭提取物抗凝血酶活性的比较研究@李友宾$江苏省中医药研究院!江苏南京210028
@张健$江苏省中医药研究院!江苏南京210028
@段金廒$南京中医药大学!江苏南京210029
@徐蓉$江苏省中医药研究院!江苏南京210028目的研究土鳖虫提取物的抗凝血作用,并与日 本医蛭抗凝活性做了比较,为土鳖虫的新药开发提供实验依据。方法采用凝血酶直接滴定法。结果 鲜(干)土鳖虫提取物的抗凝血活性均很强,与日本医蛭相当。但土鳖虫和日本医蛭抗凝血酶活性 成分对热稳定性有差异。结论土鳖虫中含有直接作用于凝血酶的成分,但不同于日本医蛭的抗凝血 酶成分。土鳖虫;;日本医蛭;;
抗凝活性;;凝血酶<1>陈可冀,欧兴长.活血化瘀药化学药理与临床
.济南:山东科学技术出版社,1995:241,284.
<2>欧兴长.水蛭活血有效成分研究概况.中国中医基础医学杂志,1997,4(2):60.
<3>贺卫和,成细华,徐爱良.土鳖虫提取液对家兔抗凝血作用的实验研究.湖南中医学院学报,2003,23(2):7.
<4>Markward F.H irud in as an inh ib itor of Thromb in-Natureally occurringactivators and inh ib itors.M ethods in Enzymology.1970,19:924.
<5>李卫星,王中枢.地鳖血纤维蛋白溶酶原激活物样成分的研究.生物化学与生物物理学 报,1989,21(4):299.拿咐嗤鈁5>,还含有抗凝血酶活性物质,其应用前景应该 比水蛭更为广阔。土鳖虫与日本医蛭提取物抗凝血酶活性的比较研究@李友宾$江苏省中医药研究院!江苏南京210028
@张健$江苏省中医药研究院!江苏南京210028
@段金廒$南京中医药大学!江苏南京210029
@徐蓉$江苏省中医药研究院!江苏南京210028目的研究土鳖虫提取物的抗凝血作用,并与日 本医蛭抗凝活性做了比较,为土鳖虫的新药开发提供实验依据。方法采用凝血酶直接滴定法。结果 鲜(干)土鳖虫提取物的抗凝血活性均很强,与日本医蛭相当。但土鳖虫和日本医蛭抗凝血酶活性 成分对热稳定性有差异。结论土鳖虫中含有直接作用于凝血酶的成分,但不同于日本医蛭的抗凝血 酶成分。土鳖虫;;日本医蛭;;抗凝活性;;凝血酶<1>陈可冀,欧兴长.活血化瘀药化学药理与临床.济南:山东科学技术出版社,1995:241,284.
<2>欧兴长.水蛭活血有效成分研究概况.中国中医基础医学杂志,1997,4(2):60.
<3>贺卫和,成细华,徐爱良.土鳖虫提取液对家兔抗凝血作用的实验研究.湖南中医学院学报,2003,23(2):7.
<4>Markward F.H irud in as an inh ib itor of Thromb in-Natureally occurringactivators and inh ib itors.M ethods in Enzymology.1970,19:924.
<5>李卫星,王中枢.地鳖血纤维蛋白溶酶原激活物样成分的研究.生物化学与生物物理学报,1989,21(4):299.
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