视网膜缺血-再灌注损伤涉及多种细胞因子表达,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是促进视网膜新生血管产生的重要因子,缺氧可使其表达增强。丹参素是 中药丹参中的水溶性有效成分,其化学结构为D(+)β-(3,4-二羟基苯基)乳酸<1>。 已有研究证明,丹参素对大鼠心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用<2>。本研究中,我们观察了 兔视网膜缺血-再灌注时VEGF的表达,以及丹参素钠对其表达的影响。1材料与方法1.1实 验动物及分组中南大学湘雅二医院实验动物中心提供的新西兰大白兔30只,体健无眼疾,体重1 .8~2.5kg,雌雄不限,随机分成3组:(1)正常对照组:兔3只(6眼),处死后摘除 眼球;(2)生理盐水对照组:兔15只(30眼),双眼均为实验用眼,分别于缺血-再灌注0 h、3h、24h、48h、168h处死3只兔(6眼);(3)丹参素钠组:兔12只(24 眼),双眼均为实验用眼,分别于缺血-再灌注3h、24h、48h、168h处死3只兔(6 眼)。1.2实验仪器与试剂NIKON生物显微镜(UFX-Ⅱ型,日本),SHANDON自 动脱水机(CITADE12000型,英国),LEICA切片机(SM2000R型,德国) ,北航医学图像分析管理系统(CMIAS2000型)。丹参素钠(复旦大学药学院天然药化教研室),血管内皮生长因子单克隆抗体(VEGFAb-3,JH121鼠抗兔)及阳性对照片(福州迈新生物技术开发公司),链霉菌抗生物素蛋白 -过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发公司),AEC染色试剂盒(福州迈 新生物技术开发公司)。1.3兔视网膜缺血-再灌注损伤模型的制作麻醉后将兔固定于操作台上 ,剪除眼睑附近的毛发,结膜囊内滴入0.5%丁卡因眼液,0.3%氟哌酸眼液冲洗结膜囊,用 经戊二醛器械消毒液浸泡消毒的眼科剪剪开外眦部皮肤至眶缘软骨,沿角膜缘360°剪开球结膜 ,钝性分离暴露4条直肌,做直肌牵引吊线,自颞上方向眼球后钝性分离,暴露视神经,小心地钝 性分离视神经周围的包膜,充分暴露视神经,在眼球后约1.5mm处用0号黑丝线结扎视神经。 用直接检眼镜观察眼底,见后极部视盘周围视网膜变白,动脉变细,静脉扩张,血管搏动消失。6 0min后松开结扎线,10min后用直接检眼镜观察眼底,见后极部视网膜恢复红色,动、静 脉管径趋于正常。用5-0丝线缝合球结膜,用3-0丝线缝合外眦部皮肤伤口,结膜囊内滴0. 3%氟哌酸眼液,涂0.5%四环素眼膏,送回兔笼饲养。1.4丹参素钠与生理盐水给药法1. 4.1兔丹参素钠用药量的换算按人每日口服复方丹参滴丸(每次10丸,每日3次)中所含的丹 参素的量(不少于2.5mg)<3>,以每人50kg体重计,则剂量为0.05mg·kg- 1·d-1,人与兔之间按每千克体重占有体表面积相对比值换算<4>,则兔每日剂量应为:0 .05×兔的体表面积比值/人的体表面积比值=0.05×0.24/0.08=0.15(m g·kg-1)1.4.2给药方法丹参素钠组兔于再灌注开始时立即由耳缘静脉推注0.01% 丹参素钠溶液,0.15mg·kg-1,以后每日相同时间注入相同剂量,直至处死。生理盐水 组以同样方法注入0.9%氯化纳溶液1.5mL·kg-1。1.5光镜制片动物处死后摘出眼 球(每个时间段取5只眼球做光镜制片,1只留做电镜制片),立即在角膜缘后4mm做4个长约 4mm的穿刺口,浸入10%中性缓冲福尔马林液中固定48h后取出,以视神经为标记,距视神 经左右各约2mm,将眼球前后向纵行剖分成3部分,取中间部分组织制成石蜡标本,做石蜡切片 ,切片厚度为3~4μm。1.6兔视网膜VEGF表达的测定石蜡切片经脱蜡、水化,加过氧化 酶阻断剂,室温下孵育10min,在Tris-Cl溶液(pH=10.0)中进行抗原热修复,加非免疫性动物血清,室温下孵育5min,加50μLVEGF单克隆抗体,4℃过夜,加生物素标记的第2抗体,室温下孵育20min,加链亲和素- 过氧化物酶溶液,室温下孵育20min,AEC显色,苏木素复染,甘油明胶封固,光镜下观察 视网膜形态及VEGF表达变化,用医学图像分析系统定量测定节细胞VEGF光密度。1.7统计学处理所有数据均用-x±s表示,采用SPSSforWindows10.0统计软件包处理,P<0.05认为有统计学显著性差异。2结果正常对照 组视网膜内界膜、节细胞、外界膜、感光细胞层内段及色素上皮层均显示VEGF弱表达。再灌注 0h,视网膜上述部位VEGF表达均增强,节细胞VEGF光密度与正常对照组比较有显著性差 异。再灌注3h,生理盐水组与丹参素钠组视网膜内界膜、节细胞、外界膜和感光细胞层内段的V EGF表达明显增强,节细胞VEGF光密度较再灌注0h明显升高,2组间无显著性差异。再灌 注24h,生理盐表1各组兔视网膜缺血-再灌注节细胞VEGF光密度的变化Table1Changesof ganglion cells VEGF opticaldensity value in periods of retinal ischemia-reperfu-sion in rabbits in three groups(-x±s,n=5)Ti me Normal control Saline Danshensu-sodium2.58±0.750hour3.67±0.27△3hou rs6.61±0.34△6.78±0.26△24hours10.11±0.59△10. 13±0.71△48hours9.18±0.64△9.34±0.70△168hours6.45±0.43△3.63±0.33△*Note:△comparedwith normal control group,P<0.01;*compared withsaline group at same ti me,P<0.01水组与丹参素钠组视网膜上述部位VEGF表达进一步增强至最高点,节细胞V EGF光密度比再灌注3h也明显升高,2组间无显著性差异。再灌注48h,2组VEGF表达 与再灌注24h无明显变化。再灌注168h,生理盐水组VEGF表达减弱,但仍明显强于正常 对照组,节细胞VEGF光密度与再灌注3h无显著性差异;而丹参素钠组VEGF表达减弱明显 ,节细胞VEGF光密度较同时间段生理盐水组明显下降,与再灌注0h无显著性差异(见表1,图1~4)。Figure1VEGFexpression at the24th hour of reperfusionin rabbit retina in saline group(×200).Figure2VEGFexpression at the24th hourof reperfusionin rabbit retina in danshensu-sodiumgroup(×200).Figure3VEGF expression at the168th hour of reperfusionin rabbit retina insaline group(×200).Figure4VEGF expression at the168th hour of reperfusioninrabbit retinain danshensu-sodiumgroup(×200).图1生理盐水组再灌注24h兔视网 膜VEGF的表达(×200)。图2丹参素钠组再灌注24h兔视网膜VEGF的表达(×20 0)。图3生理盐水组再灌注168h兔视网膜VEGF的表达(×200)。图4丹参素钠组再 灌注168h兔视网膜VEGF的表达(×200)3讨论视网膜缺血-再灌注损伤的机制较为复 杂,近年来国内外大量研究表明视网膜缺血-再灌注损伤是多种因素综合作用的结果,其主要的损 伤机制有以下几种:(1)自由基的作用;(2)微血管损伤和白细胞的作用;(3)钙超载的作 用。视网膜缺血-再灌注中伴有多种细胞因子的参与,如P-选择蛋白与细胞间粘附分子-1、色 素上皮源性因子、碱性成纤维细胞生长因子等,这些因子通过调节白细胞的作用导致微血管损伤, 或通过钙超载发挥作用。VEGF是一种分泌型碱性蛋白,可增加血管通透性,促进血管内皮细胞 有丝分裂,并对血管内皮细胞、血管平滑肌细胞具有趋化作用。缺氧、其他生长因子、炎性介质均 可调节VEGF的表达,而缺氧是调节VEGF表达的最重要的因素<5>。VEGF在正常鼠、 猴视网膜的节细胞、内核层、色素上皮层均有表达,猴视网膜视锥细胞层也有表达<6>。另外, 视网膜毛细血管内皮细胞及周细胞也可表达VEGF<7>。本研究中,我们在正常兔视网膜节细 胞、外界膜、感光细胞层内段及色素上皮层均检测到VEGF的表达。且在缺血-再灌注0h,视 网膜上述部位的VEGF表达就已开始增强,至再灌注24h至最强,并维持到48h,再灌注168h时减弱,但仍高于正常水平。Hayashi等<8>在鼠血管结扎模型的研究中,用West-ernblots法检测视网膜缺血-再灌注期间VEGF的表达发现VEGF的15kD带在再灌注6h 明显增强,然后逐渐减弱,至168h仍高于正常,这与我们的研究结果基本相符。丹参素是从丹 参水溶性部分分离出的一种有效成分,具有多种药理活性。药理研究表明,丹参素能够缩小心肌梗 塞的范围,减轻病程;改善微循环障碍,提高机体的抗凝和纤溶活性,舒张离体冠状动脉,抑制血 小板释放血管收缩物质,抑制炎性细胞因子的分泌,并具有显著延长小鼠耐缺氧时间的作用<9> 。丹参素的生物半衰期(T1/2)较短,家兔静脉注射丹参素后的药代动力学显示T1/2=(16.58±5·77)min<10>。因此,在本研究中,我们在再灌注开始时给予丹参
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