红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc)是主产于我国小兴安岭的珍贵树种。松仁具有很高的营养价值,有美容养颜、延年益寿的 功效<1>。松仁多糖是重要的天然活性物质。近年来,大量研究表明多糖及其糖复合物参与和介 导了细胞的各种生命活动,具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射及降血糖等药理作用<2>。 目前国外研究较多的有刺五加多糖、甘蔗渣多糖、稻草多糖、麦杆多糖等。我国研究比较多的有黄 芪多糖、人参多糖、牛膝多糖等。但有关松仁多糖对免疫功能影响的研究较少。本实验通过对小鼠 进行脏体比、
胸腺指数、脾细胞中的白介素-2和白介素-6的测定以及足跖增厚法和碳廓清试验 <3>,研究松仁多糖对小鼠免疫功能的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1原材料松仁, 市售一级。1.1.2试剂乙醇、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、蒽酮、硫酸、丙酮、乙醚、三氯乙酸 、碳酸钠、氯化钠等均为国产分析纯试剂。绵羊红细胞(SRBC)、印度墨汁(上海长江日用粘 合材料厂)、小鼠白介素-2和白介素-6ELISA试剂盒、RPMI-1640完全培养液、 小牛血清、四甲基偶氮唑盐(MTT)及刀豆蛋白A(ConA)。1.1.3仪器超临界萃取装 置(江苏)、756紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣 生化仪器厂)、FA25型高剪切力分散乳化机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)、冷冻干燥 机、鼓风干燥箱、高速万能粉碎机、恒温水浴锅、离心机、恒速搅拌器、精密分析天平、电子天平 、恒温CO2培养箱、酶联免疫检测仪、倒置显微镜、游标卡尺(精密度0.02mm,哈尔滨量 具刃具厂)、微量注射器(1mL、0.25mL,江西侨明医疗器械有限公司)、血色素吸管( 20μL)、计时器等。1.1.4实验动物昆明种小鼠(由黑龙江省医学实验动物提供基地提供 )共60只,体重18￣20g,雄性。按体重随机分为对照组12只、高剂量组、中剂量组及低 剂量组各16只,分别以3个剂量饲喂松仁多糖,即125、250、500mg/(kg·d) 。每周称量2次体重以调整饲喂剂量。各组均自由饮水、摄食,饲喂35d。1.2实验方法1. 2.1松仁多糖的提取<4～5>称取1kg松仁,超临界萃取大部分油脂后,以丙酮加热回流除 去剩余油脂,分别加入20、10、5L蒸馏水,90℃水浴提取3次,合并提取液,浓缩至一定 体积后加入等体积的15%的三氯乙酸,12h后离心,清液中加入3倍体积的95%乙醇,静置 过夜,离心,依次用乙醚、无水乙醇反复洗涤,真空冻干得白色粉末状的多糖。用蒽酮-硫酸法< 6>测定总糖含量为53.8%。1.2.2测定小鼠脏器/体重比值小鼠饲喂35d后,处死, 取其肝、脾和胸腺,用滤纸吸干表面血污,称重,记录数据。1.2.3小鼠细胞免疫功能的测定 采用足跖增厚法对小鼠细胞免疫功能进行检测。小鼠用体积分数为2%SRBC腹腔免疫,每只鼠 注射0.2mL(约1×108个SRBC)。免疫后4d,测量左后足跖部厚度,然后在测量部 位皮下注射体积分数为20%SRBC,每只鼠注射20μL(约1×108个SRBC),于注 射后24、48h分别测量左后足跖部厚度,同一部位测量3次,取平均值。以攻击前后足跖厚度 差值(足跖肿胀度)来表示DTH程度。1.2.4小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的测定做小鼠碳 廓清试验,对小鼠单核-巨噬细胞的吞噬功能进行检测。将小鼠称重,尾静脉注射稀释的墨汁(每l0g体重注射0.1mL),立即计时。注入墨汁2min后用毛细管从眼眶静脉丛取血20μL,迅速将其加入2mLNa2CO3溶液中,混匀。以Na2CO3溶液作为空白对照,用722分光光度计于600nm处测定光吸收值(OD1);10min后,再次从眼眶静脉丛取血20μL,将其加入2mLNa2CO3溶液中,测定光吸收值(OD2)。1.2.5小鼠脾细胞的IL-2和IL-6的测 定无菌取脾,常规制备细胞悬液,经200目筛网过滤,用PBS液洗涤,溶于2mL的含有MT T的完全培养液中,加入红细胞裂解液,离心,计活细胞数(活细胞95%以上),调整细胞浓度 为2×109个/mL。将调整后的细胞液加入3块48孔培养板中,每孔1mL。分别加入10 μg/mL的ConA,置于5%CO2、37℃培养箱中培养。每隔24h收集1块培养板中的 上清液。采用ELISA试剂盒测定小鼠的IL-2、IL-6。2结果与分析2.1松仁多糖对 小鼠体重的影响由1可见,松仁多糖饲喂5周,第1周小鼠体重有所下降,可能是由于小鼠需要时 间适应新环境所致。其后4周小鼠体重增长平稳。2.2松仁多糖对小鼠脏器/体重比值的影响脏 体比=脏器重/体重×100%胸腺指数=胸腺质量/身体质量×10表1松仁多糖对小鼠免疫器官质量的影响(X±SD)Table1Effectof pine seed polysaccharide on the weight of immunity organs in mice(X±SD)剂量脾脏脾脏重/g脾脏/体重比值/%对照组1.6215±0.1082 5.168±0.23440.08940±0.013360.2887±0.0181512 5mg/(kg·d)1.7318±0.0803*5.499±0.1627*0.1012 7±0.004245*0.4259±0.00680*250mg/(kg·d)1.800 1±0.07845*5.530±0.1574*0.15348±0.006880*0.4 532±0.01356*500mg/(kg·d)1.9368±0.0609*5.590 ±0.1563*0.1801±0.00525*0.4859±0.01594*肝脏肝脏重 /g肝脏/体重比值/%注:*P<0.05。由表1可见,松仁多糖可显著增加小鼠的脏器质量 和脏体比。各剂量组小鼠的脏器质量及脏体比与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。图1小鼠生长曲线Fig.1Growthcurvature of mice图2松仁多糖对小鼠IL-2含量的影响Fig.2Effect of pine seed polysaccharide on the contentof IL-2in mice表4松仁多糖对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响Table4Effect of pine seed polysaccharidetincture on carbon Granulation sweeping away in mice组别剂量/mg·(kg·d)-1K值对照组04.0736±0.5163低剂量12 54.5702±0.4103中剂量2504.7545±0.2523*高剂量5004.2 383±0.2852注:*P<0.05。2.4松仁多糖对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影 响对数据进行T检验,以吞噬指数表示小鼠碳廓清能力。计算廓清指数(吞噬速率)K。K=(1 gOD1-1gOD2)/(t2-tl)式中,k——廓清指数;t1——注射墨汁后第1次取 血的时间,min;t2——注射墨汁后第2次取血的时间,min;OD1——t1时的光吸收 值;OD2——t2时的光吸收值。做小鼠碳廓清实验,对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能进行评价 ,实验结果见表4。由表4可知,各剂量组的吞噬指数比对照组都有增加,且中剂量组有显著性差 异,证明松仁多糖对小鼠单核-巨噬细胞的吞噬功能有明显的增强作用。2.5小鼠脾细胞的IL -2和IL-6的测定一般认为,IL-2和IL-6是两种广谱的细胞因子,对机体的体液免疫 和细胞免疫均有重要的调节作用。由图2和图3可以看出,剂量组小鼠的IL-2和IL-6水平 均显著高于对照组。这表明松仁多糖可以增强机体的特异性体液免疫应答,补骨脂,从而参与机体的免疫调节作用。表3松仁多糖对小鼠迟发型变态反应的影响(X±SD)Table3Effectof pine seeds polysaccharide tincture on delayed hypersensitivity(DTH)in mice(X±SD)组别实验前足跖厚度/mm24h足跖厚度/mm48h后足跖厚度/mm对 照组1.718±0.037481.777±0.031111.768±0.0293012 5mg/(kg·d)1.732±0.066051.871±0.051851.883±0 .07107250mg/(kg·d)1.804±0.040221.950±0.0648 21.937±0.06482*500mg/(kg·d)1.676±0.040501.9 00±0.069121.945±0.03020注:*P<0.05。表2松仁多糖对小鼠胸腺指数的影响(X±SD)Table2Effectof pine seed polysaccharide on the thymicfactor in mice(X±SD)剂量胸腺重/g胸腺指数对照组0.08647±0.017640.027 03±0.003485125mg/(kg·d)0.09200±0.01074*0.03 031±0.001118*250mg/(kg·d)0.09565±0.01143*0. 03138±0.001779*500mg/(kg·d)0.09945±0.01058* 0.03274±0.001455*注:*P<0.05。由表2可见,各剂量组小鼠的胸腺相 对重,与对照组相比具有显著性差异(p<0.05),胸腺指数也有显著性差异。2.3松仁多 糖对小鼠细胞免疫功能的影响通过足跖增厚法对小鼠的细胞免疫功能进行评价,由表3可见,松仁 多糖对小鼠的足跖厚度有增厚的作用,且中剂量组差异性显著,由此证明松仁多糖对小鼠的细胞免疫功能有显著的增强作用。3结论通过对小鼠的脏体比、胸腺指数以及脾细胞中的白介素-2和白
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