男性不育的病因复杂,大致可归纳为影响睾丸生精功能的因素、影响精子功能的因素和影响精子输送的因素3类。在影响精子功能的因素中,活性氧类(reactive oxygen species,ROS)的过氧化损伤作用被日益关注。研究表明,生理剂量的ROS对维持正常 精子功能是必要的,但过多的ROS则会导致精子结构和功能损伤而造成不育。菟丝子(Cuscutachi-nensis)补肝肾,益精髓,是治疗男性不育症的有效药物<1>,文献报道,菟丝子 具有抗氧化作用<2-3>。本实验采用Percoll梯度离心法优选具有正常生理功能的人精 子作为正常精子模型,在有氧环境下,ROS、菟丝子水提物与精子共同培养,观察菟丝子水提物 对ROS所致人精子膜结构和功能氧化损伤的干预作用及其对精子功能的保护作用,试图为菟丝子 治疗男性不育弱精子症提供实验依据。维生素C是一种水溶性的ROS高效清除剂,还具有还原剂 的性质,在细胞内外起着重要的清除氧自由基和抗脂质过氧化作用。因此本实验以其为对照药。1 材料1·1仪器与试剂1·1·1仪器WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统(配有恒温 装置,北京伟力新世纪科技发展有限公司);MACRO精子计数盘(南京源程科技公司);2K 15C11加热型高速冷冻台式离心机(德国Sigma公司);FORMA-3111水套式二 氧化碳细胞培养箱(美国热电公司);D-SCr420可调控温三用水箱(上海锦昱科学仪器有 限公司);HP7530G紫外可见分光光度计(安捷伦科技上海分析仪器有限公司)。1·1· 2试剂及其配制Percoll液(批号P7828);10×Earle′s液(批号E751 0);1×Earle′s液(批号E7883);次黄嘌呤(hypoxanthine,HX,批号X-1882);黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase,XO,批号X-1875);维生素C(批号A-7506);D-果糖(批号: F-0127)均购自Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程研 究所,批号A001);MDA测试盒(南京建成生物工程研究所,批号A003)。90%和45%Percoll液的制备<4>:10×Earle′s液1mL与Percoll9 mL混匀,从中取出0·75 mL舍去,再加入0·75 mL超纯水,即成为渗透浓度为280 mmol·L-1的90%Percoll液。90%Percoll液5 mL与1×Earle′s液5 mL混匀,即为配制好的45%Percoll液。低渗膨胀液:柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)0·735g,果糖1·351 g,双蒸水100 mL(渗透压:150 mOsmol·kg-1,离子强度0·15)。伊红Y溶液:称量伊红Y 0·5 g,溶于等渗生理盐水100 mL中即可。其余均为实验室分析纯级常规试剂。1·2正常精子模型制备25~35岁的健康且有生育能力的自愿供精者15名,禁欲3~5 d,留取精液于无菌容器,经计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis,CASA)系统常规分析,精子密度>60×106个·mL-1,a级精子> 25%,a+b级精子>50%,正常形态精子>60%,WBC<1×106个·mL-1。采 用Percoll梯度离心法制备具有正常生理功能的精子作为实验模型。具体操作如下<4>:在14mL离心管中先加入2 mL 90%Percoll,在其上层轻缓加入2 mL 45%Percoll,然后在45%Percoll的上层轻缓加入2 mL已液化的精液;300 r·min-1离心20 min;吸去精液层和45%Percoll层,将90%Percoll层与4 mL的Earle’s液混匀,300r·min-1离心10 min;弃上清,沉淀用适量Earle’s混悬,并调精子密度为20×106个·mL-1。1 ·3实验药物及其制备1·3·1来源、鉴定菟丝子购自浙江医药股份有限公司,经我院杜静副主任药师鉴定确认为旋花科(Convolvulaceae)植物菟丝子(Cuscuta chinensisLam·)的干燥成熟种子,产自山东济南。1·3·2药物制备取菟丝子若干克加10倍量双蒸水浸泡30 min,武火煮沸,文火再煮30 min,滤布过滤,滤渣再加5倍量水同上法再处理2次,各煮沸30和15 min,合并3次滤液,用聚乙烯微孔滤管在减压下过滤,除去煎出液中的悬浮粒子,滤液于70~80℃水浴中浓缩至每1 mL药液相当于0·5 g生药量,冷藏保存备用。1·3·3固体物质含量测定准确称量菟丝子水提取液2·0 mL,置恒重的称量瓶中,于120℃电热恒温干燥箱中干燥3 h,使溶液缓慢挥发,直到其中的固体成分完全干燥为止,准确称量。平行做2次,取平均值,以每 毫升水提取液中含提取固体物克数表示。溶液的固含量可用下式计算:固含量(%)=干燥后固体 的重量/溶液的总重量×100%。2方法2·1分组将精子悬液分为6组,分别加入:正常组,PBS缓冲液(pH7·4);模型组,HX-XO(HX终浓度为1mmol·L-1,XO终含量为50 U·L-1);阳性药对照组,维生素C(终含量为0·25 g·L-1)+HX-XO(终浓度/含量同模型组);菟丝子小、中、大剂量组,菟丝子水提物(终含量分别为每1 mL含0·125,0·25,0·5 g)+HX-XO(终浓度/含量同模型组);各组样本置37℃,5%CO2培养箱中孵育1~2 h。2·2观察指标及方法2·2·1总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力测定精子悬液孵育2 h,按试剂盒说明书操作,用7530G紫外可见分光光度计测定。将试剂盒中1~4号试剂分·516·Chin Pharm J,2006 April,Vol·41 No·7中国药学杂志2006年4月第41卷第7期别加入测定管和对照管,取待测样本0·2 mL加入测定管,对照管中加入等量的双蒸水,用旋涡混匀器充分混匀,置37℃水浴40 min,各加显色剂2 mL,混匀,室温放置10 min后,倒入1 cm光径比色杯,蒸馏水调零,波长550 nm处比色,结果以每毫升酶单位表示。SOD活力单位为抑制反应50%的SOD量。计算公式: SOD活力(U·L-1)=(对照管吸光度-测定管吸光度)÷对照管吸光度÷50%×样品稀释倍数。2·2·2MDA含量测定精子悬液孵育2 h,按试剂盒说明书操作,用7530G紫外可见分光光度计测定。将试剂盒中1号试剂分别加入标 准管、标准空白管和测定管,取适量标准品(10μmol·L-1)加入标准管,标准空白管加 入等量无水乙醇,测定管加入等量精子悬液,混匀,再分别加入试剂2和试剂3,用旋涡混匀器充分混匀,试管口用保鲜膜扎紧,用针头刺一小孔,置95℃水浴40min,然后流水冷却,3 500 r·min-1离心10 min,取上清,加入1 cm光径比色杯,蒸馏水调零,532 nm处比色。精子膜脂质过氧化损伤的程度以MDA的产量来表示(1 nmol代表1×108个精子)。计算公式:MDA含量=(测定管吸光度-标准空白管吸光度) ÷(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10μmol·L-1)×样品稀释倍数。2·2·3精子低渗膨胀实验(HOS)<5>精子悬液孵育30min,取待检标本0·1 mL,加37℃预温的低渗膨胀液0·85 mL,混匀,置37℃水浴30 min;再加入伊红Y溶液0·05 mL,混匀;室温放置2 min后取5~10μL于载玻片上,盖上盖玻片,高倍镜下计数200个精子中b~g型精子百分率(人精子尾部低渗膨胀分b~g 6型,b~g型精子尾部呈不同程度膨胀,g型精子整个尾部膨大呈球状,说明精子膜无损伤,精子功能良好)。2·2·4精子存活率精子悬液孵育1,3,6 h后分别取5μL与等量的0·5%伊红Y溶液混匀,于22℃温育2 min,然后加盖玻片,在明视野400倍镜下观察,活精子不着色,死精子被染成红色。每份标本计数200个精子计算精子存活率。2·3统计学方法结果用-x±s表示,采用SPSS 12·0统计软件包进行方差齐性检验和单因素方差分析,以判断各组间的显著性。3结果3·1对T-SOD活力、MDA含量的影响精子悬液孵育2 h后,与正常组相比,模型组的T-SOD活力显著降低(P<0·001),MDA含量显著增高 (P<0·001),维生素C组和菟丝子水提物小、中、大剂量组的T-SOD活力明显高于正 常组和模型组(P<0·001),MDA含量显著低于模型组(P<0·001)。对T-SOD活力和MDA含量的影响,菟丝子水提物大剂量组与维生素C组(0·25g·L-1)之间无明显差异(P>0·05),但菟丝子水提物中剂量组则显著优于维生素C组(P<0·01),表1。表1各组T-SOD活力、MDA含量·n=15,-x±sTab1 T-SOD vigor,MDA content of each group·n=15,-x±sGroup Dose/g·mL-1SOD vigor/U·mL-1MDA content/nmol·10-8Normal 11·62±1·72 24·03±1·81Model 7·90±1·741)46·72±2·021)Vit C 0·25 g·L-120·45±1·872)31·39±2·542)C.chinensis0·125 15·19±1·742)33·69±1·902)3)0·25 26·38±2·092)4)27·75±2·152)4)0·5 21·71±2·212)29·00±2·752)注:1)P<0·001,与正常组比较;2)P<0·001,与模型组比较;3)P<0·01
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