脑出血后血肿周围组织水肿(perihematoma tis-sue,PHT)是脑出血病理生理学的重要环节。脑出血后水肿导致的脑疝形成是患者病 情恶化或死亡的主要原因之一,同时,脑水肿也可加重出血后缺血、炎症反应等病理过程的发生。 脑出血后脑水肿的发生发展的机制至今未完全阐明,临床上虽有甘露醇脱水治疗,但却只能针对血 管源性脑水肿,对细胞毒性脑水肿却几无作用。本实验在复制胶原酶所致大鼠脑出血模型的基础上 ,对新清开灵注射液治疗脑出血后脑水肿及相关环节的影响作用进行了药理学研究。材料与方法1 动物雄性清洁级Wistar大鼠,体重200～250g,购于北京维通利华动物中心,动物质 量合格证号为:SCXK(京)2002—0003。2药物与试剂新清开灵注射液(简称新清开 灵,由栀子甙、黄芩甙、珍珠母、猪去氧胆酸等组成),阳性对照药为清开灵注射液(简称清开灵 ,由胆酸、珍珠母、猪去氧胆酸、栀子、水牛角、板蓝根、黄芩甙、金银花组成),两药均由北京中医药大学药厂提供。Ⅶ型胶原酶购于Sigma公司;基质蛋白酶-9(matrixmetallopro-teinase-9,MMP-9)Elisa试剂盒为Biosource公司产品;肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)放免试剂盒为解放军总医院东亚放射免疫所产品。3主要仪器SN-2型脑立体定位仪,日本NARISHIGE公司产品;ULTI MA型电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES),法国JY公司产品;680型酶标仪, 日本BIO-RAD公司产品。4模型制作参照Rosenberg等方法〔1〕,取大鼠100 只,10%水合氯醛4ml/kg腹腔麻醉,俯卧位固定在脑立体定位仪上,切开头顶部皮肤,暴露颅骨,以大鼠前囟为“0”点,在后lmm,右旁开3.5mm处钻开颅骨,将微量注射器插入脑组织(深度为5mm),再缓慢注入0. 5μl胶原酶,留针10min,破坏尾壳核内脑血管基底膜胶原纤维,大鼠局部脑实质出血即造 模成功。5动物分组与给药造模成功的大鼠随机分成5组,每组20只,即模型组、清开灵组、新 清开灵小剂量组、中剂量组和大剂量组(简称新清开灵小、中、大组),另取正常大鼠20只不做 处理(作正常组)。模型组大鼠腹腔注射生理盐水10ml/kg,清开灵组给予清开灵注射液3 ml/kg,新清开灵小、中、大组分别给予新清开灵注射液1.5ml/kg、3ml/kg、 6ml/kg,分别将相应药物用生理盐水稀释至注入液体量为10ml/kg,每日给药1次, 给药2天,均腹腔注射。6检测指标与方法用10%水合氯醛4ml/kg予大鼠深度麻醉后,于 冰上操作,每组平均分成两批,第1批大鼠断头取脑,切取大鼠右侧大脑,称重,待测脑含水量和 Ca元素含量。第2批则打开腹腔,从腹主动脉抽取动脉血,静置,然后取脑,切取大鼠右侧大脑 血肿周围脑组织200mg,以生理盐水稀释成40%比例,电动匀浆机匀浆;之后,将所取动脉 血3000r/min离心10min,取上清待测MMP-9含量;而脑组织匀浆则4℃130 00r/min离心15min,取上清待测TNF-α含量。6.1脑含水量测定采用干湿重法 。所取脑组织于电子分析天平称取湿重后,于80℃烤箱烘烤至恒重后(约48h),称取干重。 脑含水量(%)=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%。6.2Ca元素含量测定用原子吸收 分光光度法。脑组织80℃烘干4h,冷却后用电子天平准确称量,放入聚四氟乙烯高压罐内,加 入1ml硝酸,拧紧钢套于烘箱中160℃加热4h,冷却后用高纯水定容至10ml,选取谱线 为315.887nm,上机测定。6.3MMP-9含量测定用双抗体夹心酶联免疫吸附(AB C-ELISA)法。首先设标准孔8孔,每孔中各加入1000、500、250、125、6 2.5、32、16ng/ml的标准品100μl,第8孔为空白对照;将待测孔中每孔加入血 清100μl,将反应板充分混匀后置37℃120min;反应后,用洗涤液将反应板充分洗涤 4～6次,用滤纸印干后;然后每孔中加第一抗体工作液50μl,置37℃60min,洗板同 前;继之后每孔加酶标抗体工作液置100μl,置37℃60min,再洗板同前;每孔加入底 物工作液100μl,置37℃暗处反应10min;每孔中加1滴浓硫酸终止反应;最后在酶标 仪492nm谱线处测吸光度OD值。其次是由OD值计算出样品血清中MMP-9的含量:所有 OD值均减除空白值后得到绝对OD值;以标准品各浓度相应之OD值在半对数纸上作图,画出标 准曲线;根据样品血清的OD值在曲线图上查出相应MMP-9含量。6.4TNF-α含量测定 用放免-液相竞争法检测脑组织匀浆。按说明书加样后,加入分离剂后充分混匀,放室温20mi n,4℃3500r/min离心25min,吸弃上清液,在自动γ计数器上测放射性,并测出 标准曲线及样品浓度。7统计学方法采用t检验和方差分析。结果1各组大鼠脑含水量测定结果见 表1。与正常组大鼠比较,模型组大鼠脑含水量显著升高(P<0.01);与模型组比较,新清 开灵3个剂量组大鼠脑含水量均显著降低(P<0.05或P<0.01),清开灵组脑含水量差 异无显著性,说明新清开灵注射液对脑水肿有减轻作用。2各组大鼠脑组织Ca含量测定结果见表 1。与正常组大鼠比较,模型组大鼠脑组织Ca含量显著升高(P<0.01);与模型组比较, 新清开灵小、大组大鼠脑组织中Ca含量显著下降(P<0.05或P<0.01),清开灵组和 新清开灵中组大鼠脑组织Ca含量差异无显著性,说明新清开灵小剂量和大剂量可降低脑出血后脑 组织Ca含量。表1各组大鼠脑出血后脑含水量和脑组织Ca含量测定结果比较(x-±s)组别 鼠数脑含水量(%)脑组织Ca(μg/g)正常878.56±0.36247.21±51. 51模型780.60±0.75*456.66±139.45*清开灵679.94±0.8 5398.39±115.39新清开灵小879.35±0.59△△356.02±86.9 6△中679.82±0.98△404.51±116.91大1079.39±0.55△△ 312.69±63.29△△注:与正常组比较,*P<0.01;与模型组比较,△P<0. 05,△△P<0.013各组大鼠血清MMP-9含量测定结果见表2。与正常组大鼠比较,模 型组大鼠血清MMP-9含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,新清开灵3个剂量组大 鼠血清MMP-9均显著降低(P<0.01);而清开灵组血清MMP-9含量差异无显著性。 说明新清开灵可阻抑血清MMP-9的释放。4各组大鼠脑组织TNF-α含量测定结果见表2。 与正常组大鼠比较,模型组大鼠脑组织TNF-α含量显著升高(P<0.01);与模型组比较 ,清开灵组和新清开灵3个剂量组大鼠脑组织TNF-α含量均显著下降(P<0.01),说明 两种清开灵注射液均可降低TNF-α的含量。表2各组大鼠血清MMP-9和脑组织TNF-α 含量测定结果比较(μg/L,x-±s)组别鼠数血清MMP-9脑组织TNF-α正常101 24.68±12.172.80±0.23模型10140.76±14.37*3.23±0 .14*清开灵8128.54±6.712.79±0.16△新清开灵小10128.14± 8.43△2.86±0.20△中9126.98±8.22△2.84±0.34△大101 21.52±5.66△2.31±0.11△注:与正常组比较,*P<0.01;与模型组比 较,△P<0.01讨论清开灵注射液在以往治疗脑出血的临床实践中取得了良好的疗效,但因其 具有过敏和致热等不良反应,从而使得其广泛应用受到了限制。国家973项目(No.G199 9054404)中“祛邪扶正方剂的研究———清开灵阻抑中风病缺血级联反应的药效物质与作 用机理”利用指纹图谱与多环节病理过程的药理分析相结合的方法,确定了清开灵注射液对中风病 病理过程产生主要有益影响的有效组分、组分配伍的化学特征以及多组分在多环节的作用形式,而 且发现了其作用环节的配伍效应、不良反应的主要因素,在去掉金银花、水牛角、板蓝根的基础上 组成了新清开灵注射液。本实验在复制胶原酶所致大鼠脑尾壳核出血模型的基础上,对新清开灵注 射液治疗脑出血后脑水肿及相关环节的影响作用进行了药理学研究。一般认为脑出血后脑水肿是混 合性水肿,既存在血管源性水肿,亦发生细胞源性水肿,脑血肿的物理因素及血管收缩物质等〔2 〕因素共同加剧脑水肿的形成;张军等〔3〕认为炎症反应亦在脑水肿的形成过程中起到一定的作 用。以往的实验表明〔4,5〕,脑水肿于血肿形成之时即发生,之后快速发展,24～48h达 到高峰。Ca2+几乎参与一切调控细胞功能的信息转导过程,在脑出血发病过程中,细胞内Ca 2+超载可引起神经细胞蛋白质和磷脂代谢紊乱,导致严重的细胞毒性脑水肿。有研究结果显示〔 6〕,脑出血后脑组织含水量随着神经细胞Ca2+浓度的升高而增加,说明脑水肿的发生发展与 Ca2+超载有着密切的关系。早期Ca2+大量内流,可能是导致脑水肿的始动因素。还有研究 表明,脑组织总钙含量能一定程度上反应神经细胞Ca2+通道.246.中国中西医结的变化〔 7,8〕,所以本实验所采用的原子吸收分光光度法检测脑组织中钙元素含量能反映Ca2+的活 性。MMP-9是一种可降解细胞外基质(extracellular-ma-trix,EC M)明胶、Ⅳ、Ⅴ型胶原和弹性蛋白等成分的蛋白酶。脑出血后MMP-9被释放和激活,促进ECM降解,使其完整性遭受破坏,血脑屏障通透性增加,由此造成血液中水分和中性粒细胞游出,造成血肿周围的脑组织含水量增加〔9〕。TNF-α是一种具有广泛生物学功能的多肽类细胞因子,在中枢神经系统中主要由神经元、星形胶质细
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