核酸识体(Aptamer)是近年来发展起来的一类经体外人工进化程序筛选出的寡聚核苷酸,因 其能高效、特异地结合各种配体,具有易合成、易储存和易修饰等优点,在医学诊断治疗、药物分 子设计以及分析检测等方面的应用已引起了人们的极大关注<1>.发展无需分离洗脱样品且在均 相溶液中快速实时检测混合组分中靶分子的信号核酸识体是目前较为活跃的研究方向.信号核酸识 体通常是标记一个或两个荧光基团的核酸识体,利用它与靶分子结合时荧光信号的变化可实现靶分 子的检测<2>.然而要使核酸识体的荧光标记不影响它与配体的结合,标记位点往往难以确定; 同时已筛选出的大部分核酸识体都是RNA,其自身的不稳定性给荧光标记带来一定的困难.最近 我们研究出了利用DNA光开关化合物
2+(RU)与核酸识体 复合物作为信号核酸识体的新方法,该法无需对核酸识体进行荧光基团标记,成功地实现了蛋白质 大分子和ATP小分子的检测<3,4>.本文进一步利用这种信号核酸识体的原理,建立了检测 药物分子托普霉素的高效简便方法.托普霉素是广谱氨基糖苷类抗 生素之一,常用于治疗恶性革兰氏感染.由于这类氨基糖苷类抗生素具有潜在的耳毒性和肾毒性, 对它的检测在药物研究中备受关注<5~10>.与其它所有氨基糖苷一样,托普霉素的分子结构 中缺少不饱和共轭键,自身没有紫外或荧光吸收,因此,目前对它的检测方法主要是色谱法<5>、毛细管电泳法<7,8>和ELISA<9>等.但前两种方法的检测限都在200~900nmol/L,灵敏度不高.ELISA法虽将检测限提高至53 nmol/L,但操作步骤较繁杂.最近报道的循环伏安法可用于碱性条件(pH>9)下检测3·4 nmol/L托普霉素衍生物<10>.本文利用基于信号核F ig.1 C hem ica l stru ctu res of TO B(A),TO B RNA ap tam er(B)and RU(C)酸识体的荧光分析方法检测托普霉素,方法简单,选择性高,能在均相中性溶液中进行直接检测,检测限为10 nmol/L.1998年W ang等<11>筛选出托普霉素的RNA核酸识体后,人们利用标记荧光基团的托普霉素研究了托 普霉素与其RNA核酸识体相互作用的机理,认为托普霉素RNA核酸识体分子可折叠成环-茎结 构,从而使托普霉素分子结合于环-茎连接附近的RNA大沟处<11,12>,但尚未见到直接 利用RNA核酸识体检测药物分子的报道.本文的实验结果为进一步拓展核酸识体在药物分析检测 中的应用提供了新思路.1实验部分1.1试剂与仪器托普霉素(Tobramycin)、庆大 霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)、链霉素(Streptomycin)、红霉素(Erythromycin)和有机小分子D-无水葡萄糖(D-Glucose)均购自Sigma公司(St.Louis,MO,美国);α-凝血酶的RNA核酸识体5-′GAGCA UGCUG GUGCG GCUUU GGGCG CCGUG CUU-3′及托普霉素的RNA核酸识体5-′GGCAC GAGGU UUAGC UACAC UCGUG CC-3′均由Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA,美国)合成;光开关复合物2+的合成方法见文献<13>.实验中均使用超纯水(Milli-Q,18.2 MΩ)制备样品,所有用到的器皿以及配制样品溶液的水和缓冲溶液均用电热手提式压力蒸气消毒器(YXQ SG46 280型,哈尔滨松花江医疗器械厂)进行灭菌处理.实验中所用缓冲溶液除特别说明外均为PBS缓冲溶液(10 mmol/L KH2PO4,pH=6·8).1.2荧光测量实验中使用Fluorolog 3-21荧光分光光度计(Jobin Yvon,Inc.,Ed ison,美国)和1 mL石英样品池,探针RU荧光测量的激发和发射波长分别为450和615 nm,激发和发射的狭缝均设为12 nm.2结果与讨论2.1信号核酸识体RNA/RU本实验选取由W ang等<11>筛选出的托普霉素27-nt为RNA核酸识体.从其二级结构<图1(B)>可 以看出,虽然核酸识体是单链RNA,但其分子内部分碱基仍能配对,折叠成环-茎结构,其茎部 大约有10个碱基对.而被称为DNA光开关复合物的荧光探针RU<结构见图1(C)>能够嵌 入到碱基对中,从而产生荧光信号<3>.如图2所示,RU和RNA核酸识体本身在水溶液中都没有荧光(图2谱线a和b),但当将二者混合后,在波长约615nm处的荧光信号增加了25倍以上(图2谱线c).这一结果表明,与我们开发的蛋白质和ATP的信号核酸识体类似<3,4>,在水溶液中RU探针dppz配体上的N原子F ig.2 T he lum inescence em ission spectra of RU(a),TO B RNA ap tam er(b),m ixtu re of the ap tam erand RU w ithou t(c)or w ith(d)TO B,theTO B(e),the m ixtu re of RU and TO B(f)andthe m ixtu re of the throm b in RNA ap tam er andRU w ithou t(g)or w ith(h)TO BThe concentrations of the two aptam ers,RU and TOB were5×10-8,5×10-7and 5×10-7mol/L,respectively.20 mmol/L HEPES buffer(pH=7.4)was used.与水分子形成氢键而使荧光猝灭;当托普霉素核酸识体存在时,dppz配体通过插入到 RNA的疏水空腔中使其N原子被保护起来,RU发出荧光.当加入托普霉素后,RNA/RU荧 光信号明显下降(图2谱线d),而其它药物分子的加入都不能引起荧光信号的显著变化(图2) .这是因为托普霉素与RNA核酸识体的结合可能使RNA的构象发生了变化或使部分RU探针被 排出RNA双链区<3>.因此能够通过荧光探针信号的变化来检测药物分子托普霉素.我们还做 了其它一些对照实验:一方面,托普霉素本身(图2谱线e)及托普霉素和2+的混合液(图2谱线f)均没有荧光;另一方面,在其它RNA核酸识体( 如α-凝血酶RNA核酸识体)和RU的混合液中加入托普霉素,虽然可能由于其RNA核酸识体 有两个环-茎结构使嵌入的RU减少,荧光信号较低,但在TOB加入的前后,其荧光信号也没有 明显变化(图2谱线g和h).这些结果进一步表明图2谱线d荧光信号的变化确实是由于托普霉 素和核酸识体特异结合后引起的.用光开关化合物2+/RNA 核酸识体作为检测药物托普霉素的信号探针是可行的.2.2滴定曲线绘制了托普霉素在其RNA 核酸识体/RU信号体系中的滴定曲线.首先考察了RNA核酸识体在不同摩尔浓度RU加入后的 荧光强度变化,确定当RU荧光探针与核酸识体浓度比为8∶1时,荧光强度达到最大值,即染料 的嵌入达到饱和.以此比例的荧光探针与核酸识体混合溶液用来滴定托普霉素,结果如图3所示. 由图3可见,随着托普霉素的加入,溶液的荧光强度不断下降,最后达到平台(下降约30%).在一定的浓度范围内(托普霉素0~100nmol/L),托普霉素的浓度与荧光强度的下降量有较好的线性关系(图3插图,线性拟合的相关系数为0·966).以信噪比大于3为可测信号标准,经实验得到托普霉素的检测限为10nmol/L,优于多数已有文献的报道结果<5~9>.F ig.3 T itra tion of the RU/RNA ap tam er w ith TO B inthe concen tra tion range of 0—1 000 nm o l/LInset:the linear relationsh ip of the lum inescence change ofthe RU/aptam er at 615 nm and the TOB concentration.Theconcentrations of the aptam er and RU were 1×10-8and8×10-8mol/L,respectively.F ig.4 D ifferen t d rug m o lecu les and sm a ll organ icm o lecu les com pared w ith TO B in the ir capa-b ility to change the lum inescence in ten sity ofthe RU/ap tam er1×10-7mol/L TOB aptam er and 1×10-6mol/L RU;the concentrations of all drugs were 3×10-7mol/L.2.3选择性我们研究了一组与托普霉素具有相似结构的氨基糖苷类抗生 素(庆大霉素、新霉素、链霉素和红霉素)和有机小分子D-无水葡萄糖对核酸识体/RU体系荧 光信号的影响<6>,结果如图4所示.由图4可见,只有托普霉素能够使核酸识体/RU体系荧 光信号发生明显的降低.由于托普霉素与其核酸识体的结合具有高特异性,因此用这一信号核酸识 体检测托普霉素也具有很好的选择性.2.4离子强度和pH的影响溶液中阳离子往往会影响核酸与RU的结合<14>以及核酸识体与靶分子
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