前言无论在基础和临床研究中,人们对吸入麻醉药物预处理作用的研究越来越多,很多证据显示在缺 血前和缺血后使用吸入麻醉药可以起到神经保护作用<1-2>。研究表明这种神经保护作用是通 过复杂信号通路参与的,这些信号通路包括腺苷受体<3>、蛋白激酶C(PKC)<4~5>和三磷酸腺苷(ATP)调节的钾通道(KATP)<6>。麻醉预处理(anestheticpreconditioning,APC)和缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)有着相似的作用而且可能和IPC共享一些信号转导通 路。研究表明反复多次短暂的缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR) 比单次缺血再灌注更能够有效的激发IPC的保护作用。这提示在每次缺血再灌注期间都会有IP C的临界调节物不断积聚,而且,短暂缺血期后的再灌注本身可能就是一种临界调节物能激发IP C的保护效应。虽然有研究显示单次和多次APC都可以剂量依赖性的诱导神经保护作用<6>, 但是对单次和反复预处理作用进行比较的研究还未见报道。本研究的目的在于探讨是否两次异氟醚预处理要比单次预处理更为有效。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)属于比较古老的信号分子并控制着一系列的生理过程 <7>,影响基因表达、有丝分裂、新陈代谢和细胞死亡。不断增加的研究证明不论在缺血和药物预处理中ERK1/2和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)的活化在细胞保护的起源上都起着很重要的作用<8~9>。至今为止还没有对其在AP C中的作用进行研究。本研究在于探讨MAPKs信号通路在APC诱导的神经保护中的重要作用。1材料和方法1.1材料S-D大鼠,雌雄不拘,70g~90 g,由徐州医学院实验动物中心提供。Isoflurane由日本Dinabot公司提供,U0 126和SB203580由美国Promega公司提供。1.2离体海马脑片的制备动物在乙 醚麻醉下,迅速断头取脑,置于0℃~4℃经95%O2~5%CO2混合气体饱合的ACSF中 ,剥离海马,国产VSL振动切片机沿矢状面切片,厚度400μm然后将海马脑片置于34℃的ACSF中孵育2h~3h,并不断通入95%O2~5%CO2
混合气体。ACSF成分:NaCl124 mmol/L,KCl 3.3 mmol/L,NaH2PO41.24mmol/L,MgSO42.4 mmol/L,NaHCO325.7 mmol/L,CaCl22.4 mmol/L,葡萄糖10.0 mmol/L,pH7.35~7.45。1.3 PS的记录将孵育后脑片全浸于34℃恒温灌流槽内,液面高出脑片表面2 mm,不断通入经95%O2~5%CO2混合气体饱和的ACSF(气体流量为200 ml/min),ACSF的灌流速度为1.5 ml/min~2 ml/min。双极刺激电极置于海马CA3区的Schaffer侧支路径上,刺激强度为0.2mA~0.8 mA。玻璃微电极(内充4 mmol/LNaCl溶液,阻抗2 MΩ~10MΩ)置于CA1区锥体细胞层,记录电刺激诱发的PS。电位输入电脑,HYD22000电生理系统处理软件进行处理。选取电位波幅大于3 mV的脑片,待PS波形稳定30 min后进行后续实验。1.4实验程序OGD:将灌流液改为经95%N2~5%CO2混合气体饱和的无糖ACSF13 min。异氟醚预处理:用预先加热、加湿的95%O2~5%CO2的混合气体中通入异氟醚挥发罐后通入ACSF中平衡20 min,其浓度用麻醉气体监测仪上的vol%表示。单次预处理用异氟醚平衡后的ACSF罐流脑片30 min,然后用不含异氟醚的ACSF将异氟醚洗出,时间15min,再进行13 min OGD处理;两次预处理是将以上预处理方法重复两次,再进行13 min OGD处理。MAPKs在异氟醚预处理中的作用研究:将ERK1/2抑制剂U0126(10μmol/L)及p38 MAPK抑制剂SB203580(2μmol/L)先溶于DMSO(1 mmol/L)中,再溶于ACSF中并在异氟醚预处理前10 min对脑片灌流处理。1.5实验分组1.5.1异氟醚预处理作用研究分7组:OGD对照组(n=12):对海马脑片不使用异氟醚预处理只进行13min OGD处理;Iso1-1、Iso2-1和Iso3-1组(每组n=12):分别使用1vol%、2vol%和3vol%的异氟醚对海马脑片预处理30 min,洗出15 min;Iso1-2、Iso2-2和Iso3-2组(每组n=12):分别使用1vol%、2vol%和3vol%的异氟醚对海马脑片进行预处理两次,每次30 min,每次预处理后进行15 min的洗出过程;所有异氟醚组在洗出15min后,进行13 min的OGD处理。1.5.2 MAPKs作用研究分7组:OGD对照组(n=12):对海马脑片不使用异氟醚和MAPKs抑制剂预处理只进行13 min OGD处理;Iso组(n=12):用3vol%的异氟醚对海马脑片进行预处理两次,每次30 min,每次预处理后进行15 min的洗出过程;U0126和SB203580组(每组n=12):OGD前10 min开始对海马脑片分别使用含U0126(10μmol/L)和SB203580(2μmo l/L)的ACSF灌流;Iso+U和Iso+SB组(每组n=12):在异氟醚预处理两次前10min开始对海马脑片分别使用含U0126(10μmol/L)和SB203580(2μmol/L)的ACSF灌流;DMSO组(n=12):OGD前对海马脑片使用1 mmol/L的DMSO处理(U0126和SB203580的溶酶)。1.6观察指标PS恢复 幅度:恢复正常脑脊液灌流30min后PS波幅与初始PS波幅之百分比。1.7数据处理所有 数据用x±s表示,使用SPSS11.0统计软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析(ANO-VA),P<0.05差异有统计学意义。2结果在OGD组中,PS的初始波幅为6.2mV±0.8 mV。在OGD随后,PS波幅消失,恢复正常脑脊液灌注后PS波幅的恢复很有限(0.28 mV±0.06 mV),为初始波幅的4.75%±1.39%。在其它各实验组,PS的初始波幅和OGD组没有 差别(P>0.5)。在所有异氟醚预处理组中,PS的初始波幅和异氟醚洗出后的波幅变化不超 过5%。异氟醚单次预处理的神经保护作用呈浓度依赖性。在OGD组神经功能的恢复仅为4.8 %±1.4%。异氟醚单次预处理明显提高神经功能的恢复幅度,其中1vol%、2vol%和 3vol%的异氟醚分别使神经功能恢复幅度提高为41.9%±9.2%、55.1%±11. 0%和63.2%±10.8%;异氟醚两次预处理提高了这种保护作用,其中1vol%、2v ol%和3vol%的异氟醚两次预处理分别使神经功能恢复幅度提高为53.8%±12.0% 、63.5%±11.1%和76.3%±12.3%;本研究还发现在相同的浓度下,两次预处理的神经保护作用比单次预处理明显提高(P<0.05,Iso1-2vs Iso1-1和Iso3-2 vs Iso3-1),而且相同的浓度下,两次低浓度异氟醚预处理和一次高浓度异氟醚预处理的神经保 护作用没有差别,Iso1-2组和Iso2-1组相比及Iso2-2组和Iso3-1组相比 没有明显差别(P>0.3),表1。表1异氟醚预处理对海马脑片OGD损伤的影响(n=12 ,x±s)组别OGD组Iso1-1组Iso2-1组Iso3-1组Iso1-2组Iso2-2组Iso3-2组PS恢复幅度(%)4.8±1.441.9±9.2155.0±11.01◆63.2±10.91◆◆53.8±12.01◆6 3.5±11.11◆◆76.3±12.31◆◆●△★#与OGD组比较,1P<0.01与 Iso1-1组比较,◆P<0.05◆◆P<0.01与Iso2-1组比较,●P<0.01 与Iso3-1组比较,△P<0.05与Iso1-2组比较,★P<0.01与Iso2-2组比较,#P<0.05使用ERK1/2抑制剂U0126和p38MAPK抑制剂SB203580对神经的恢复幅度没有影响(6.1%±1.6%和5.9%±1 .8%),但U0126取消了3vol%异氟醚两次预处理诱导的神经保护作用(6.1%±1 .5%)。这提示异氟醚预处理诱导的神经保护作用是通过ERK1/2信号通路的激活而实现的 。SB203580对异氟醚两次预处理诱导的神经保护作用没有影响(65.9%±6.6%),DMSO对OGD组神经功能恢复也没有影响(图1)。图1MAPK抑制剂对异氟醚两次预处理诱导的神经保护作用的影响图示为OGD组、Iso组(3vo l%异氟醚预处理两次组)、U0126组、SB203580组、Iso+U组和Iso+SB 组的PS在OGD后复灌30min的PS恢复幅度,与OGD组比较,1P<01;与Iso组 比较,◆P<01;与U0126组比较,*P<0.01;与SB203580组比较,●P< 0.01;与DMSO组比较,★P<0.01;与Iso+U组比较,#P<0.01;
异氟醚 组和Iso+SB组相比没有差别(P>0.05)。3讨论海马脑片是研究全麻药很好的实验模 型,在中枢神经系统中海马可能为麻醉药作用的主要靶位。本研究发现异氟醚预处理诱导的神经保 护作用不仅和药物浓度有关,而且和药物的预处理次数有关。本研究第一次发现相同浓度异氟醚两次预处理比单次预处理提高了其对神经功能的保护作用,而且使用低浓度的异氟醚两次
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