引言现代生物技术药物制造工艺中,其产品多为注射用药,因此对热原必须进行严格的控制。通常并 不是每一种热原都具有脂多糖的结构,但所有已知的细菌内毒素都具有热原活性,在药品生产质量管理规范(GMP)条件下生产的生物制品,一般不存在内毒素就意味着不存在热原。在生物制品分离纯化的生产过 程中,内毒素的产生、检测、去除及预防等有其自身的特点,我们将从以下几个方面进行讨论。1 内毒素的物化特点及产生1.1内毒素的物化特点细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多 糖和微量蛋白的复合物,它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物,而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A3部分组成。类脂A是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性,所以各 属细菌的类脂A结构相似,其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血,并 导致休克等。内毒素不是蛋白质,热稳定性强。在100℃的高温下加热1h也不会被破坏,115℃30min湿热仅能破坏25%左右的热原质。只有180℃3~4h或250℃1~2h干烤,或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30m in才能破坏它的生物活性。内毒素带有负电荷,由于脂多糖结构中类脂A的疏水性,使得内毒素倾向于以高分子聚合物的状态存在而难溶于水,并由于环境中C a2+、M g2+等被吸引到带负电荷的脂多糖上而得以稳定。通常其分子量几十万至上百万道尔顿。1.2内 毒素的产生基因工程蛋白通常采用细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主进行大规模发酵 生产,但大多是以大肠菌作为表达系统。以大肠杆菌作为表达系统的蛋白通常都是在胞内表达,在 纯化蛋白之前必须通过高压匀浆、超声波破碎或低压渗透等方法将菌种破壁,以释放蛋白。同时细 胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中,通常10%的湿菌浓度可产生几万EU·mL-1的内毒 素,这是内毒素的主要来源。对于酵母表达系统或CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)系统等,虽然表 达系统本身不产生内毒素,但在生产过程中因原辅材料,生产环境以及个人操作等因素造成产品内 毒素污染,这是产生内毒素的另一来源.2在生产过程中如何防止内毒素污染2.1粗纯中防止内 毒素污染无论是酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞表达系统还是大肠杆菌表达系统,在生产过程中 以各种途径利用各种方法有效地防止内毒素污染均是非常重要的。前者本身不产生内毒素,只要在 生产过程中能有效防止内毒素的污染,就可以得到热原合格的产品;后者虽然不可避免地产生内毒 素,但通常在初步纯化中已采取有效措施,可以大量减少内毒素含量。2.2精制纯化中防止产品的再污染首先,生产车间必须是符合GMP要求的洁净厂房,各种不同的操作在不同的洁净区内进行,例如发酵和粗纯应该在十万级区进行, 精纯在万级区域内进行,制剂、分装须在百级间或层流罩下进行操作。对于任何非封闭系统的操作 ,均应采取无菌操作方式,如果系统自动化程度较高,可遥控操作或较少手工操作。另外,对于任 何直接接触制品的溶液、容器、生产用具、管路、生产系统等必须进行严格有效的处理,去除热原 。用蒸馏法或反渗法制备的新鲜注射用水或灭菌注射用水通常都是无热原的,这是清洗器具及配制 溶液的基础。生产器具一类是玻璃器皿,不锈钢制品,这些器具可置180℃3~4h或250℃1~2h干烤,除去热原。另一类为橡胶、塑料制品,如胶塞、胶管等,可采用0.1mol·L-1盐酸煮沸30m in,或0.1m ol·L-1氢氧化钠浸泡4h以上,急用时可煮沸30m in,然后用新鲜注射用水冲洗净,再高压灭菌。对于生物制药的某些关键步骤可采用无菌、无热原 的一次性器具,既可以减轻劳动量,又可以防止清洗不净带来的污染。溶液配制要使用无热原的新 鲜注射用水,整个过程必须于3h内完成,并及时高压灭菌。对于一些不能灭菌的溶液,可通过超 滤法除热原。如(PBS)在高压灭菌时会产生具有紫外吸收的焦磷酸,在使用磷酸盐液缓液(P BS)进行柱层析时,就对层析图谱产生干扰,在干扰素的生产与检定中曾经出现过这样的问题,采用截留相对分子质量(NMWL)为10.000的超滤膜超滤可有效去除溶液中的热原。生物技术药品的生产中,对于系统、管路的清洗涉及原位清洗/原位灭菌(C IP/S IP)的概念〔1,2〕,主要是针对泵、管道、阀门、滤器、柱、各种罐等需定期清洗灭菌的设备 ,常规要求在不拆卸任何组件的情况下原位进行。例如层析系统,它是生物技术药品生产中最普遍 使用的单元操作,原位清洗/原位灭菌〔2〕十分重要,有效的原位清洗可以减少产品污染的危险 性、维持柱效和提高介质寿命。新一代的凝胶具有较高的物理化学稳定性,可以使用较高浓度的氢氧化钠作原位清洗。对于离子交换或疏水层析介质,如CM-SepharoseF F可使用1m ol·L-1N aOH反向清洗一个柱床体积,如果每使用3次清洗1次,其寿命可达1000次;而对于凝胶过滤介质如Sephacry l等系列,可使用0.5m ol·L-1N aOH清洗半个柱床体积,接触1~2h,如果每使用5次清洗1次,寿命可达800次。在白蛋白的纯化流程中,对SephadexG-25C的原位清洗为0.5m ol·L-1N aOH清洗0.2个柱床体积,每使用4次清洗1次,介质寿命可达7200次〔2〕。3细菌内毒 素的检测〔3,4〕细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素 ,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。鲎试剂法的反应机理是细菌内毒素 在二价阳离子参与下激活鲎血细胞溶解物中的一系列凝聚酶的反应。其包括两种方法,即凝胶法和 光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。检测时可用其中任一种方法,当结果有争议时,除另 有规定外,以凝胶法结果为准。鲎试剂法具有简便、迅速、定量准确、灵敏度高等优点,在国际上 受到广泛应用,已被美国、欧洲、日本等国《药典》及《生物制品规程》收载,我国2005年版 药典也已收载,应用于药品、生物制品的热原检定。4细菌内毒素的去除在生物技术药品的生产过 程中除去内毒素包含两方面内容,首先是在生产工艺的设计中采取措施去除菌体破碎所带来的内毒 素,这实际上是与去除杂蛋白,纯化目标产品结合在一起的,其次是一旦产品污染了内毒素如何将 之去除。4.1生产中采取措施去除内毒素生物技术药品的纯化,主要是采用各种柱层析技术,如 疏水层析、离子交换、亲和层析、分子筛等,这些技术纯化目标产品的同时也可以有效去除内毒素 。4.1.1疏水层析:内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性,但在高盐下会凝集,无法挂上疏水 层析柱。可选择能结合目标蛋白的疏水介质而去除内毒素。4.1.2离子交换:离子交换法是通 过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。内毒素在pH>2时带负电荷,与阴离子交换介质Q或DEAESepharoseF ast F low有较强结合,可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或N aOH去除,这是离子交换法去除内毒素的基础。Pharm acia公司已开发利用离子交换层析法从白蛋白中去除内毒素的工艺,主要采用DEAE Sepharose F ast F low介质,将被内毒素污染的白蛋白上柱,白蛋白和大部分内毒素结合于介质上,先清洗掉不结合的内毒素,然后选择性洗脱白蛋白,而90%的内毒素仍结合在柱上,最后用N aOH将柱清洗干净。用此种方法每批可以处理20kg内毒素含量达20ng·mL-1的白蛋白 。4.1.3亲合层析:亲合层析技术,特别是免疫吸附剂在生产中的运用使得生物大分子的纯化 变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用,以目标蛋白作为抗原,将通过杂交瘤技 术生产的单克隆抗体偶联于介质上,以此介质来吸附目标蛋白。由于相互作用的高度特异性,理论 上仅有目标蛋白吸附于介质上,内毒素全部穿透,洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。实际上, 由于介质本身存在的非特异性吸附,仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附,但内毒素含量是极低 的。在干扰素(IFN)生产中,洗脱物内毒素含量一般为0.25EU·mL-1。4.1.4 分子筛:分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。一般重组产品分子量为 几万道尔顿,而内毒素分子量为几十万至上百万道尔顿,常是多聚体,因此利用分子筛可以有效去 除内毒素,但其处理量小,处理时间较长。4.2被污染的产品去除内毒素即使在生产中采取了有 效的工艺和严格的预防措施,原液仍有可能被污染,如何处理已被污染的原液是比较棘手的问题。 因为原液中通常已加入保护剂,重新纯化是非常困难的。如果原液及保护剂的分子量与内毒素分子量差别较大,那么选用适当的(NMWL)的超滤膜,通过超滤来去除内毒素是可能的,但由于膜吸附过程中产热及系统残留等原因,活性 损失较大。目前较为有效的处理方法是采用亲和层析技术〔5〕,将内毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶联于CNB r-Sepharose或NHS-Sepharose上,以此介质特异性吸附内毒素,而让蛋白通过。我们曾使用美国S terogene生物分离公司的ACT ICLEAN ETOX凝胶。该产品介绍中指出其最大内毒素结合量为血清中2000EU·mL-1胶,水中2 0000EU·mL-1胶。我们使用此凝胶处理被污染的含白蛋白的干扰素,可得吸附量170 0EU·mL-1胶,去除内毒素效果较好,但活性有一定损失。此产品的另一优点是高化学稳定性,可用1mol·L-1N aOH清洗2~14h,但其寿命仅1年左右。以上结合生物技术药品的生产讨论了内毒素的产生、 预防、检测及去除,而生产中关键是将生产工艺中目标蛋白纯化与内毒素去除结合起来并有效防止内毒素的污染。一旦污染了内毒素,
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