18β-
甘草次酸(18-βGA)是甘草中所含三萜类化合物甘草甜素水解后脱去两分子葡萄糖酸 的产物,常温下为白色针状结晶。研究表明,18β-GA具有抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血脂、 镇咳、平喘、祛痰等主要作用<1~2>。近年来随着药理学实验方法的发展,还发现具有抗病毒 性肝炎<3>、抗癌<4>、抗艾滋病毒<5>的作用,更加激发了人们对甘草次酸及其衍生物的 研究热情。但是,18β-GA的水溶性差以及高浓度时对正常细胞的毒性制约了其在临床上的应 用。为了获得高效、低毒的新药物,人们制备了一系列18β-GA衍生物,包括在结构中引入亲 水基团以提高其生物利用度从而提高疗效<6>。在衍生物的制备过程中,反应主要通过18β- GA结构中C20位上的羧基和C3位上的羟基进行。聚乙二醇是一种亲水性很强的合成高分子, 作为蛋白质修饰剂得到了广泛应用。近年来,也陆续有用聚乙二醇修饰小分子药物的报道,如冯霞 等用聚乙二醇修饰紫杉醇,提高了紫杉醇的水溶性,得到了一种新的聚乙二醇给药系统<7>。本 文通过将18β-GA结构中C20位上的羧基与氨基PEG结合,得到了18β-GA的PEG
轭合物。实验结果表明,这种轭合物的水溶性比18β-GA提高了近280倍,使用B16小鼠 黑色素瘤细胞测定了轭合物的细胞毒性,其细胞毒性与对照物18β-甘草次酸相当。1实验部分1.1试剂与仪器18β-甘草次酸、三硝基苯磺酸(TNBS)购自Sigm a公司;平均分子量为5 000的单甲氧基聚乙二醇(mPEG 5000)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,分析纯)购自F luka公司;二环己基碳二亚胺(DCC,分析纯);C-50介质购自安玛西亚公司。四唑盐( MTT)购自上海思吉公司;B16小鼠黑色素瘤细胞株购自中科院上海细胞所;1640培养基为Gibco产品;小牛血清购自杭州四季青公司。红外光谱仪为F ITRvector 22(B ruker.Inc),紫外扫描分光光度计为UV 2300(Spectrom eter)。其他试剂均为分析纯。1.2实验方法1.2.1 18β-GA聚乙二醇轭合物的制备和表征(1)PEG-NH2的制备:取mPEG 5000 10 g(2mm o l)加入300 mL分析纯甲苯中,加热蒸馏出150mL以共沸除水,然后加入4 mm o l的氯化亚砜,再缓慢滴加4 mm o l的无水吡啶后回流反应8 h,过滤后减压将体系蒸干。残渣用干燥的二氯甲烷溶解后,再用无水乙醚沉淀出产物,得到mPEG-C l,将得到的mPEG-C l在液氨的作用下胺化得到mPEG-NH2,用TNBS法测定产物氨基含量确定产率。(2)PEG-18β-GA轭合物的制备:取0.47 g(1mm o l)18β-GA溶于30 mL精制的二氯甲烷中,加入2倍摩尔量的DCC和NHS,然后加入1.2倍摩尔量的mPEG-NH2室温下搅拌反应48 h,反应液抽提,滤液经乙醚沉淀后真空干燥,干燥后的产物溶于2 mL重蒸水中,用0.01 m o l/L的氢氧化钠溶液调节至pH 8.0后,用氯仿抽提。经过乙醚沉淀后再经过C-50介质(4.0 cm×65 cm)分离,洗脱液为pH 4.0的醋酸缓冲液,收集吸收波长在248 nm的聚乙二醇组分并用氯仿抽提,乙醚沉淀得PEG-18β-GA轭合物。反应过程见图1。( 3)PEG-18β-GA的表征:分别采用紫外分光光度法和红外光谱法对结合物PEG-18β-GA进行了表征。取终产物PEG-18β-GA用无水乙醇配成溶液,在200~400nm波长范围内进行扫描,得到其最大吸收波长。红外光谱技术显示PEG-18β-GA中有酰胺键的出现。1.2.2 PEG-18β-GA水解性测定称取2 m g18β-GA或PEG-18β-GA,溶解在10 mL被辛醇饱和的水里,置于50 mL分液漏斗中,加入10 mL被水饱和的辛醇,充分振荡后静置30 m in使分层清晰,分别测定两液层在248 nm下的吸光度,计算PEG-18β-GA和18β-GA在水-辛醇中的分配系数。1.2.3 PEG-18β-GA抗肿瘤活性测试采用噻唑蓝(MTT)比色法测定B16小鼠黑色素瘤细胞的 存活率<8>。B16细胞置于含5%CO2、37°C的培养箱中培养,培养液为含10%小牛血清的1640培养液(添加100U/mL青霉素,100 U/mL链霉素)。待对数生长期时用0.25%的胰酶消化细胞,然后以每孔接种1×105个的 浓度接入96孔细胞培养板,设置对照组,每组3孔,依次加入各浓度的18β-GA和PEG-18β-GA。药物作用48h后每孔加入20μL 5m g/mL MTT,反应4 h,吸干培养液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DM SO),在培养箱中放置10 m in,待紫色结晶物完全溶解后用酶联免疫检测仪在550nm波长处测定其光吸收值。2结果与讨论2.1 PEG-18-βGA的合成与产物的分离在多肽合成中,人们通常通过缩合剂DCC的作用使一个 氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合形成肽。在这里,通过这个原理使18β-GA的羧基与 mPEG-NH2的氨基缩合形成目的产物PEG-18β-GA。反应完成后,从有机相中过滤除去生成的二环图1PEG-18β-GA的合成路线F ig.1 Syn thetic rou te of PEG-18β-GA己基脲(DCU)后,再用乙醚沉淀,得到一个混合物。这个混合物中除了目 的产物PEG-18β-GA外,还有未反应的18β-GA和mPEG-NH2。将此混合物溶解于去离子水中,用NaOH调节溶液的pH为8,使18β-GA形成钠盐,然后用氯仿将PEG-18β-GA和mP EG-NH2萃取出来,18β-GA的钠盐留在水相中。将上述氯仿中的物质用乙醚沉淀出来,在C50介质中通过离子交换使PEG-18β-GA和mPEG-NH2分离,得到PEG-18β-GA。2.2 PEG-18-βGA的表征对PEG-18β-GA无水乙醇溶液进行波长扫描,得到其在248 nm处有最大吸收峰,这说明轭合物中含有18β-GA结构。合成终产物PEG-18β-GA的红外吸收如下,3 200 cm-1(—OH);2 800 cm-1(PEG骨架);1 674 cm-1(—CONH);1 650 cm-1、1 630 cm-1(双键共轭羰基)。终产物PEG-18β-GA的红外光谱中出现酰胺键的特征红外吸收 说明,再次验证了PEG-18β-GA具有18β-GA结构。2.3紫外分光光度法测定18-βGA及PEG-18β-GA的含量在200~400nm波长扫描发现18β-GA在248nm下有最强的吸收峰,在此波长下以18β-GA无水乙 醇溶液的吸光度对溶液浓度作图,得到18β-GA的吸光度-浓度标准曲线,如图2所示。测定 所制备的PEG-18β-GA无水乙醇溶液的吸光度,由标准曲线确定其中18β-GA含量,除以PEG-18β-GA样品量,得出PEG-18β-GA中的18β-GA含量。图218β-GA的浓度对紫外吸收的标准曲线F ig.2 S tandard p lot of UV absorbace vs concen tration of18β-CA由图2可见,在所研究的浓度范围内,18β-GA的吸光度与浓度呈良好的线性关系(R2=0.982 3)。因此,用紫外吸光度法确定18β-GA含量是可行的。另外,考虑到18β-GA在248 nm下明显的紫外吸收来源于其分子中特定的共扼环状结构,PEG-18β-GA中18β-GA以外的其他成分如PEG都不会在248 nm产生有效吸收,所以PEG-18β-GA溶液在该波长下的吸收可认为仅仅由其中的18β- GA引起,吸光度大小与18β-GA的含量成正比。由此方法得到产物中PEG-18β-GA的含量为95.8%。2.4PEG-18-βGA的溶解性测定18β-GA及制备的PEG-18β-GA样品在水与辛醇中 的分配系数,以18β-GA的分配系数为1确定PEG-18β-GA的相对值来代表其水溶性 大小。从实验结果看,18β-GA在水与辛醇体系中的分配系数为1∶100,而PEG-18 β-GA在水与辛醇体系中的分配系数为2.8∶1.0,因此,PEG-18β-GA的水溶性 与18β-GA相比有明显提高,约为18β-GA的280倍,表明所制备的PEG-18β-GA达到了预期的提高水溶性的目的。2.5PEG-18-βGA的抗肿瘤活性设置空白对照用MTT法测定了18β-GA和PEG-18β-GA对B16小鼠黑色素瘤细胞生长的抑制作用,以细胞存活率(550 nm吸光值)对18β-GA及PEG-18β-GA浓度作图,结果见图3。由图3可见,PEG -18β-GA对B16小鼠黑色素瘤细胞生长的抑制作用与18β-GA相当,说明PEG的修饰没有明显改变GA的抗肿瘤活性。图3不同浓度18β-GA和PEG-18β-GA对B16细胞生长的影响F ig.3 G row th inh ib ition of B 16 ce lls at d ifferen t concen-tration of 18-βGA and PEG-18β-GA—PEG-18β-GA;■—18β-GA;*—P<0.05;**—P <0.013结论(1)将PEG-NH2通过酰胺键连接到18β-GA上,制得了新的化合物 PEG-18β-GA。(2)所制备的PEG-18β-GA与18β-GA相比,水溶性提高 了约280倍。(3)对肿瘤细胞的体外活性实验表明,相同浓度下PEG-18β-GA与18 β-GA具有相近抑制效果。18β-甘草次酸聚乙二醇轭合物的合成及其体外抗肿瘤活性@洪玮$华东理工大学生物反应器工程国家重点实