尼美舒利对氯化钴诱导的BGC-823细胞HIF-1α及V EGF表达的影响

研究发现,肿瘤组织内存在低氧区,低氧诱导的血管内皮生长因子(VEGF)表达上调是导致肿瘤新生血管化的关键事件<1>。低氧调节VEGF是由转录因子低氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)介导的<2>。多种恶性肿瘤组织HIF1α表达 升高,并与肿瘤血管生成和VEGF表达呈正相关<3>。环氧合酶(COX)在多种肿瘤组织中 表达升高并与VEGF和肿瘤血管密度呈正相关<4>。低氧可以刺激多种细胞表达COX2<5 ,6>。因此作者推测COX2抑制剂可能通过抑制低氧诱导的HIF1α表达,进而抑制HIF 1的靶基因VEGF的表达。为此,作者观察了选择性COX2抑制剂尼美舒利对低氧模拟剂氯化 钴诱导的胃癌细胞株BGC823HIF1α和VEGF表达的影响。1材料与方法1.1材料R PMI1640培养基,GIBCO公司;胎牛血清(FCS),杭州四季青公司;氯化钴(Co )、尼美舒利(Nim)、二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司,Co以三蒸水配成0 .01mol/L备用,Nim用DMSO溶解配成0.1mol/L,-20℃储存备用;兔抗人HIF1α和VEGF多克隆抗体、SABC试剂盒、WesternblotDAB显色法检测试剂盒购自武汉博士德公司;总RNA提取试剂Trizol购自Invitro gen公司;MMLV第一链cDNA合成试剂盒及PCR扩增试剂盒购自北京博大泰克公司;1 000bpDNAladder及PCR引物由上海生物工程公司合成。1.2细胞培养及分组选 用低分化的人胃腺癌细胞株BGC823(引自郑州大学微生物与免疫学教研室),在含体积分数 10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基中加青霉素(100U/ml)及链霉素(100 mg/L),37℃,体积分数5%CO2及饱和湿度条件下培养。细胞生长至60%～70%融 合后,以含体积分数0.1%胎牛血清的RPMI1640培养基(空白培养基)继续培养24h 后,分5组培养。①正常对照组(Nor组):空白培养基。②Co组:150μmol/LCo 加空白培养基。③Nim组:Nim1、2、3组以150μmol/LCo分别加10μmol/L、40μmol/L和80μmol/LNim,加空白培养基。Co组与Nim1、2、3组继续培养24h后收集细胞。1.3RT PCR检测HIF1α及VEGFmRNA用Trizol提取总RNA。紫外分光光度计测样品浓 度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,用MMLV第一链cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。取反转录产物4μl行PCR反应。HIF1α引物为:5′AGCCGCTGGAGACACAAT3′(1223)和5′TCGGAAG GACTAGGTGTCTGA3′(1488),产物大小302bp;VEGF引物为:5′G CCTTGCCTTGCTGCTCTA3′(51)和5′TAACTCAAGCTGCCTCGCC3′(519),产物大小505bp;内参照βactin引物为:5′ACGGCATCGTCACCAACT3′(236)和5′CAATGCCAGGG TACATGGT3′(910),产物大小710bp。反应条件:94℃变性1min,55℃ 复性1min,72℃延伸1min,32个循环,最后72℃延伸10min。产物用15g/ L琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶图像分析系统分析,以目的基因与βactinmRNA 电泳带的荧光强度比值作为目的基因的相对表达量。1.4Westernblot检测HIF1α和VEGF蛋白收集细胞,细胞裂解液裂解,蛋白抽提上样,进行100g/LSDSPAGE电泳,半干法电转移法100V恒压电泳1.5h,将蛋白转印到PVDF膜上。室温下用 TBS阻断1h;50g/L脱脂奶粉封闭1h后加一抗(兔抗人HIF1α和VEGF多克隆抗 体,工作浓度1400),37℃1h,洗膜;加二抗(生物素化山羊抗兔IgG抗体,工作浓 度1400),37℃2h,洗膜;DAB显色。Westernblot条带用Quanti tyOne图像分析软件包进行光密度计算。1.5统计学处理数据用x±s表示,用SPSS1 1.0软件包分析,检验水准α=0.05。2结果2.1BGC823细胞HIF1α、VEGFmRNA的表达RTPCR电泳结果见图1,mRNA相对表达量见表1。表1显示,Co显著增加VEGFmRNA的表达,Nim对Co诱导的VEGFmRNA表达增加有抑制作用,且呈剂量依赖性。图1RTPCR检测电泳图表1各组BGC823细胞HIF1α、VEGFmRNA的相对表达量组别nHIF1αVEGF Nor组40.9447±0.01440.2656±0.0171Co组40.9628±0. 02120.9535±0.0144Nim1组40.9736±0.01610.6318± 0.0131#Nim2组40.9842±0.01530.4221±0.0159#Nim 3组40.9815±0.01560.2782±0.0203#与Nor组相比,P<0.0 1;#与Co组相比,P<0.012.2BGC823细胞HIF1α、VEGF蛋白的表达W esternblot检测结果见图2,表2。表2显示,Co刺激24h,BGC823细胞H IF1α及VEGF蛋白表达均增高,Nim对Co诱导的HIF1α和VEGF蛋白表达呈剂量依赖性抑制作用。表2各组BGC823细胞HIF1α、VEGF蛋白的表达组别nHIF1αVEGFNor组45.00±1.1422.46±1.35Co组495.24±2.6587.59± 2.48Nim1组471.45±1.78#67.33±1.73#Nim2组442.27 ±1.72#43.51±1.18#Nim3组47.35±1.15#24.71±1.17 #与Nor组相比,P<0.01;#与Co组相比,P<0.01图2Westernblot 检测Nim对Co刺激的BGC823细胞HIF1α、VEGF蛋白表达的影响3讨论研究发现 ,低氧诱导剂Co可刺激胃癌BGC823细胞COX2及VEGFmRNA和蛋白表达,也诱导 HIF1α蛋白表达,但对HIF1αmRNA表达水平无影响<7>。作者进一步研究了选择性 COX2抑制剂Nim对Co刺激的BGC823细胞株HIF1α和VEGF表达的影响。结果 显示,Nim呈剂量依赖性地抑制VEGFmRNA和蛋白表达及HIF1α蛋白表达,但对HI F1αmRNA表达无影响,与Liu等<6,8>在人前列腺癌细胞株PC3ML的研究相符, 他们发现Co和低氧强烈诱导人前列腺癌细胞株PC3MLCOX2及VEGFmRNA和蛋白的 表达,COX2特异抑制剂NS398则可阻断VEGF的表达,而外源性PGE2可逆转NS3 98的这种作用;进一步研究证明PGE2通过EP2和EP4受体,分别激活MAPK和PI3 K/AKT激酶途径,促进HIF1α磷酸化、核转位并使之稳定化,从而促进VEGFmRNA 的表达。Fukuda等<9>对结肠癌细胞株HCT116的研究也表明PGE2通过结合于E P1受体刺激MAPK和AKT磷酸化,诱导HIF1α蛋白和VEGFmRNA表达。Jone s等<10>则证明非选择性COX抑制剂吲哚美辛和选择性COX2抑制剂NS398均可通过 促进VHL抑癌基因表达、增加HIF1α蛋白的泛素化和蛋白酶体降解抑制低氧诱导的胃黏膜微 血管内皮细胞HIF1α、VEGF的表达,外源性PGE2部分逆转这种作用。因此可推测PG E2是通过一定的信号转导途径促进HIF1α蛋白水平升高,从而调控VEGF的表达,其在低 氧调节的HIF1α及VEGF表达中可能扮演关键角色。本研究结果为应用COX2抑制剂抗胃 癌血管生成治疗提供了初步的理论依据。尼美舒利对氯化钴诱导的BGC-823细胞HIF-1α及VEGF表达的影响@冯玉光$潍坊医学院消化内科!潍坊2610002郑州大学第一附属医院消化内科郑州450052
@李建生$郑州大学第一附属医院消化内科!郑州450052
@宗红$郑州大学第一附属医院消化内科!郑州450052
@张金平$郑州大学第一附属医院消化内科!郑州450052
@陈香宇$郑州大学第一附属医院消化内科!郑州450052目的:研究选择性COX2抑制剂尼 美舒利对低氧模拟剂氯化钴诱导的胃癌细胞株BGC823HIF1α、VEGF表达的影响。方 法:分别应用150μmol/L氯化钴单独或联合10μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的尼美舒利作用于BGC823细胞24h,收集细胞,应用RTPCR和Westernblot技术检测HIF1α及VEGF的表达。以胎牛血清加RPMI1 640培养基培养细胞作正常对照。结果:与正常对照组比较,150μmol/L氯化钴刺激2 4h,可显著提高细胞HIF1α蛋白、VEGFmRNA和蛋白的表达(P<0.01),但对 HIF1αmRNA表达无影响。与氯化钴单独作用比较,尼美舒利和氯化钴联合作用24h,细 胞HIF1α蛋白、VEGFmRNA和蛋白表达降低(P<0.01),并呈剂量依赖性,但对 HIF1αmRNA表达无影响。结论:COX2抑制剂尼美舒利可抑制氯化钴诱导的HIF1α 、VEGF表达,这可能是其抗肿瘤血管生成的机制之一。胃肿瘤;;低氧;;环氧合酶-2抑制 剂;;低氧诱导因子-1α;;血管内皮生长因子1　HockelM,VaupeP.Tumorhypoxia:definitionsandcurrentclinical,biologic,andmolecularaspects.JNatlCancerInst,2001,93(4):266
2　ForsytheJA,JiangBH,I