黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellariabaicalensis Georgi)的干燥根,黄酮类化合物为其主要有效成分。现代药理研究证明黄芩具有抗氧化、抗 变态反应、抗炎、抗致癌和抗病毒的作用。我们采用二氧化碳超临界萃取——大孔树脂吸附技术联 用对黄芩有效部位群黄芩总黄酮进行了富集,本研究采用黄芩总黄酮进行试验。本文主要探讨其对 巨噬细胞吞噬功能及COX-2的影响<1,2>,以期初步研究黄芩总黄酮在抗变态反应、抗氧 化、抗炎方面的作用,为将其开发成为新型抗炎和免疫抑制药物提供依据。1材料与方法1.1受 试药物黄芩总黄酮(含量为80%)由本院制剂室提供;所用黄芩原生药材产于甘肃,购自深圳市 药材公司,鉴定为正品。1.2实验动物BALB/c小鼠,20～22g,雌雄各半,由深圳大 学实验动物中心提供。1.3试剂鲁米诺(Luminol)、趋化三肽(fMLP)、脂多糖( LPS)、花生四烯酸(AA)均为Sigma公司产品,PGE2放免试剂盒由解放军总院放免 研究所提供。1.4仪器SHG-C型生物化学发光检测仪,上海上立检测仪器厂出品;LS-6 500型液体闪烁计数仪,美国Beckman公司。1.5实验方法1.5.1对小鼠腹腔巨噬 细胞吞噬功能的影响<3>取小鼠3O只,按体重随机分为表1所列各组,按表1灌胃给药,每天 1次,对照组给等体积的蒸馏水,连续7d。末次给药后,每鼠ip1O%蛋白胨0.2ml,3 2h后ip新鲜鸡红细胞悬液0.5ml(健康鸡翼下采血1ml,滴入5倍体积的Alsver s溶液中,用灭菌生理盐水洗涤后,配制5%(v/v)的细胞悬液),30min后处死小鼠, 剖腹,洗出腹腔液,37℃温育15min后离心,取细胞悬液涂片,甲醇固定,Giemsa染 色,在油镜下计数200个巨噬细胞,计算吞噬百分数和吞噬指数。吞噬百分数=吞噬鸡红细胞的 巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100%吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞 1.5.2对fMLP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发的影响<4>小鼠腹腔巨噬细胞的制备: 健康BALB/c小鼠引颈处死,经75%乙醇消毒后,腹腔注射无菌冰冷无钙、镁及酚红的Ha nks液,打开腹腔,收集腹腔液,l000r/min,离心5min,以0.83%NH4C l溶解残余红细胞,洗涤3次,用HBSS调至2×106个/ml。瑞氏染色法检验纯度大于9 7%,台盼蓝检验细胞活力大于95%,置4℃保存备用。取细胞悬液1ml,按表2加入不同量 的受试药物(终浓度1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml),37℃孵育10mi n后依次加入Luminol(终浓度5μmol/L)及fMLP(终浓度20μmol/L) ,37℃恒温连续测定发光强度(Chemiluminescence,CL)。每份样品均设 复管,结果以抑制百分率表示。抑制百分率=〔(对照组锋值-对照组本底)-(受试组锋值-受 试组本底)〕/(对照组锋值-对照组本底)×100%1.5.3对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬 细胞COX-2酶的影响<5>取实验2制备的细胞悬液1ml于24孔培养板中,置于5%CO 2,37℃,二氧化碳孵育箱中培养1h,加入LPS(终浓度为1μg/ml,对照组不加LP S),培养6h后,新鲜培养液洗涤3次,按表3分别加入不同的受试药物(终浓度分别为1μg /ml,10μg/ml,100μg/ml),孵育30min,加入底物AA(终浓度为8μ mol/L),孵育20min,取上清液,按试剂盒要求测定其中PGE2浓度。1.6统计数 据以均数±标准差(X±S)表示,各药物组分别与对照组在SAS中行T-TEST程序。2实 验结果2.1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表1。
总黄酮100mg/kg、200 mg/kg剂量组能显著降低小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分数,总黄酮50mg/kg、100m g/kg、200mg/kg剂量组均能显著降低小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数。结果表明黄芩总 黄酮能显著抑制小鼠对鸡红细胞的吞噬,提示其能抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。2.2对f MLP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发的影响结果见表2。总黄酮1μg/ml、10μg/m l、100μg/ml剂量组均能极显著降低呼吸爆发的峰值,抑制率随剂量增加而增大。结果表 明黄芩总黄酮能抑制fMLP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发。2.3对LPS诱导的小鼠腹腔 巨噬细胞COX-2酶的影响结果见表3。总黄酮100μg/ml剂量组能显著降低PGE2值 ;总黄酮1μg/ml、10μg/ml剂量组能降低PGE2值,无统计学意义。结果表明黄芩 总黄酮能降低LPS刺激引起的小鼠腹腔巨噬细胞COX-2的合成。3讨论当机体处于急慢性炎 症时,可释放过量的自由基而加重组织损伤,成为炎症的重要病理过程。巨噬细胞吞噬功能是组成 炎症的重要环节,观察药物对吞噬过程的影响是探讨抗炎药物作用机理的必要手段<2,6>。巨 噬细胞受到刺激或进行吞噬作用后,会产生呼吸爆发,表现为吞噬细胞爆发性地增加氧的消耗,分 子氧通过NADPH氧化酶作用形成超氧离子,超氧离子歧化产生过氧化物和超氧化物。通过超微 弱化学发光技术可以观察到由活性氧产生的化学发光<7>。环氧合酶-2(Cyclooxyg enase-2,COX-2)是前列腺素(PGs)合成过程中一个重要的限速酶,在细胞受到 刺激后迅速合成,它将花生四烯酸(Arachi-donciacid,AA)代谢成各种前列 腺素产物。一般认为,COX-2呈诱导性表达,它主要表达在巨噬细胞、成纤维细胞、软骨细胞 、上皮细胞、内皮细胞、关节滑膜、肾小球致密斑等一些与炎症有密切关系的细胞或组织上,在炎 症因子和/或细胞因子的刺激下大量表达,参与炎症反应的发生和发展,且其表达水平与炎症的严 重程度相关<8>。本研究结果表明黄芩总黄酮能显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬, 与剂量有一定的相关性,提示其能抑制小鼠的吞噬功能;fMLP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆 发研究结果表明黄芩总黄酮能显著抑制过氧化物和超氧化物的产生,提示其对小鼠腹腔巨噬细胞呼 吸爆发呈抑制作用。由于黄芩中黄酮因其大都具有酚羟基结构,具有强烈的抗氧化活性,故抑制过 氧化物和超氧化物的产生可能是抑制呼吸爆发的结果,也可能是清除呼吸爆发产生的活性氧的结果 。黄芩总黄酮能抑制小鼠腹腔巨噬细胞COX-2的合成,提示其能对AA代谢产生影响,表现出 一定的抗炎作用,但是否激活了AA的另一代谢途径:5-LOX途径,产生致炎性LTs,对机 体内的平衡产生新的干扰,这有待进一步的研究与探索。综上,黄芩总黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞吞 噬功能、呼吸爆发、COX-2酶合成均有一定的抑制作用,表明在抗氧化、抗炎方面的有一定的 作用,为将其开发成为新型抗炎和免疫抑制药值得进一步深入研究。黄芩总黄酮对小鼠腹腔巨噬细 胞呼吸爆发及COX-2的影响@况夏$深圳市东湖医院药剂科!广东深圳518000目的探讨 黄芩总黄酮在抗氧化、抗炎方面的作用。方法通过小鼠腹腔巨噬细胞(PM)吞噬鸡红细胞试验 研究对巨噬细胞吞噬功能的影响;对趋化三肽(fMLP)诱导的小鼠PM呼吸爆发的影响;对 脂多糖(LPS)诱导小鼠PM合成COX-2酶的影响。结果黄芩总黄酮100mg/kg、 200mg/kg剂量组能显著降低小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分数、吞噬指数;黄芩总黄酮1μ g/ml、10μg/ml、100μg/ml剂量组均能极显著降低呼吸爆发的峰值,抑制率随 剂量增加而增大;黄芩总黄酮100μg/ml剂量组能显著降低PGE2值,黄芩总黄酮1μg /ml、10μg/ml剂量组能降低PGE2值,无统计学意义。结论黄芩总黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、呼吸爆发、COX-2酶合成均有一定的抑制作用,这可能是其抗氧化、抗炎作用的部分机理。
黄芩;;总黄酮;;
吞噬功能;;呼吸爆发;;COX-2酶<1>HaddadJJ.Antioxidant and prooxidant mecha-nisms inthe regulation of redox(y)-sensi-tive transcription factors
.Cell Signal,2002,14:879-897.
<2>王顺友.吞噬细胞呼吸爆发的分子机制.国外医学免疫学分册,1989,12(3):116-119.
<3>徐淑云.药理实验方法学.
<4>刘峻,唐庆九,王峥涛.新穿心莲内酯对小鼠巨噬细胞呼吸爆发及淋巴细胞增殖的影响.中国新药与临床杂志,2005,24(3):206-209.
<5>陈美,梁统,周克元.原花青素对脂多糖诱导RAW264.7细胞COX-2酶活性、mRNA及蛋白表达的影响.广东医学院生化教研室,广东湛江524023.
<6>邢宇坤,张伟.中性粒细胞呼吸爆发的产生机制及其炎症效应.基础医学与临床,2004,24(1):1-6.
<7>Huie RE,Padmaja S.Reaction of NO with O2-.Free Radic Res Commun,1993,l8:l95-l99.
<8>O’Banion MK.Cyclooxygenase-2:molecu-lar biology,pharmacology,and neurobiology.Crit Rev Neurobiol,I999,13:45-82.骨痪奘上赴约煜赴耐淌?与剂量有一定 的相关性,提示其能抑制小鼠的吞噬功能;fMLP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发研究结果表 明黄芩总黄酮能显著抑制过氧化物和超氧化物的产生,提示其对小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发呈抑制作用。由于黄芩中黄酮因其大都具有酚羟基结构,具
More abstracts about the 黄芩总黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发及COX-2的影响