钙离子(Ca2+)在细胞的生命活动中具有重要作用,所有类型细胞的各种功能均不同程度地被C a2+调控<1>。李氏5号方的主要中药成分有龟甲、地龙、石菖蒲、当归及酸枣仁等,多年临 床实践证明,该方对脑组织发育不全、神经损伤及神经退行性疾病有较好的疗效<2～4>,而神 经退行性疾病与钙离子稳态的失衡密切相关<5>,为此,我们探讨了李氏5号方对神经元内游离 钙浓度的影响,以期为揭示其治疗神经退行性疾病的分子机制提供实验依据。1材料与方法Sig ma公司。其他试剂均为国产分析纯。李氏5号方药粉蒸馏提取挥发油后,按常规煎制成50mg /ml(每1ml含50mg粉剂),800r/min离心,取上清水煎液,挥发油加适量吐温 80助溶后,加入水煎液中拌匀,调整pH值为7.4,高压灭菌,即为李氏5号方水提液(LQ ET)。4℃保存备用。1.2大鼠海马神经元的分离培养采用Katsube等<6>的方法并 略作改动。1日龄SD大鼠,75%乙醇消毒后,剥离头皮及颅骨,取出完整脑组织,钝性分离海 马并去除血管及脑膜,将海马剪成直径为0.4mm小块,经0.125%(g/L)胰蛋白酶作用12min,用含胎牛血清的完全培养基(10%胎牛血清、10mmol/LHEPES、105U/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM/F12)终止消化,吸管吹打 组织块10次左右以分散细胞。将细胞悬液经孔径依次为400目、500目尼龙网过滤,然后将 滤液加入盛有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板中,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培 养细胞至密度为5×109/L。第3天时加入5μmol/L阿糖胞苷,再经24h后换为完全 培养液,以后每3天换液1次,每次换1/3。第9～12天用于钙成像测定游离钙。1.3细胞 游离钙浓度测定<7>将Fluo-3/AM溶于DMSO中,终浓度为1mmol/L,作为贮 存液,-20℃避光保存。用时用Fluo-3/AM孵育液稀释200倍,使作用细胞的终浓度 为5μmol/L。用Petri培养皿培养海马神经元。正常条件下培养至第8天进行实验,实 验分正常对照组、单纯LQET预处理组、单纯L-型钙通道阻断剂硝苯地平(Nifedipi ne)预处理组、LQET与硝苯地平共同作用组。各组分别加相应的处理因素继续培养24h,然后进行钙荧光测定,再通过公式换算成实际钙浓度。各组均用30mmol/LKCl使膜去极化来激活钙通道导致钙内流。正常条件下培养至第9天,Fluo-3/AM负载4 5min,观察LQET对L-型钙通道导致的钙内流引起的细胞钙荧光强度改变的急性作用。实 验分正常对照组、LQET组、硝苯地平组、LQET+硝苯地平组,均预处理10min后,用30mmol/LKCl使膜去极化来激活钙通道导致钙内流。正常条件下培养至第9天,观察LQET对NMDA导 致的钙内流引起的细胞钙荧光强度改变的急性作用。实验分正常对照组、NMDA组、NMDA+ MK-801组、LQET+NMDA+MK-801组及LQET+
硝苯地平+NMDA组。在激光扫描共聚焦显微镜(LeicaTCS SP2AOBS,德国)Ti me series程序下,对细胞XYZ平面进行动态扫描,观察细胞内钙荧光强度变化。测定于负载后 1h内完成。每间隔2s记录一次图像,曲线则连续记录。Fluo-3/AM的激发波长为48 8nm,发射波长为525nm。记录钙内流导致的荧光强度F,加入1%Triton-100 破坏细胞膜后的最大荧光强度Fmax,及再加入EDGA结合全部Ca2+后的最小荧光强度F min,按以下公式计算细胞内钙绝对浓度(nmol/L):
i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F),Kd为常数390。用专用的SIMULATE软件对测定结果进行分析。1.4统计学处理数据结果以x±s表示,组间比较采用S PSS10.0软件进行t检验,取α=0.05水平。2结果2.1LQET对培养的海马神经元游离钙浓度的影响正常培养条件下的海马神经元在30mmol/LKCl刺激下,细胞内荧光强度换算成胞浆游离钙浓度为75.67±8.65nmol/L。LQ ET预处理组细胞内游离钙浓度提高到126.35±9.35nmol/L,与正常对照组比较 差异显著(P<0.05)。硝苯地平预处理组细胞内游离钙浓度降至40.65±5.65nm ol/L,与正常对照组比较差异显著(P<0.05)。LQET+硝苯地平共同作用组细胞游 离钙浓度降至90.75±10.15nmol/L,与单纯LQET预处理组比较差异显著(P <0.05,图1)。正常培养的细胞负载Fluo-3/AM后,观察LQET对L-型钙通道 导致的钙内流引起的细胞钙荧光强度改变的作用,结果发现,硝苯地平预处理后细胞的荧光强度明 显降低到正常对照组的29.5%±8.8%(P<0.01),而LQET预处理后荧光强度明 显升高到正常对照组的172.5%±13.6%(P<0.01)。硝苯地平预处理10min 后,再用LQET预处理10min,荧光强度值为正常对照组的82.5%±9.7%,与单纯 LQET预处理比较差异显著(P<0.01)。2.2LQET对NMDA致神经元细胞内钙荧光强度的急性抑制作用在45min内细胞胞浆钙荧光强度稳定;10μmol/LNMDA能明显增加细胞内钙荧光强度(235.5%±15.5%,P<0.01),且能在某一 强度稳定;当NMDA作用使钙荧光强度增加最大时加10mmol/LNMDA特异阻断剂MK -801,细胞内钙荧光强度显著降低(143.6%±13.5%),与单纯NMDA组比较差 异显著(P<0.01);用浓度为0.5mg/ml的LQET预处理9～10min后,NM DA导致的细胞内荧光强度增强明显受抑,而MK-801无此作用;用浓度为0.5mg/ml的LQET预处理8min,再用1μmol/LL-型钙通道阻断剂恶性循环。Ca2+超负荷最终导致神经元死亡。细胞内Ca2+超负荷在缺血 后神经元凋亡的发生中起关键作用。本研究发现,培养细胞用LQET预处理后,NMDA诱导的 细胞内钙增加的程度明显降低,而用LQET预处理后再用L-型钙通道阻断剂预处理,NMDA 诱导的细胞内钙增加幅度进一步降低,提示李氏5号方能拮抗兴奋性氨基酸导致的细胞内钙超载而 保护神经元。上述结果表明,李氏5号方对神经元钙浓度的调节具有双向性,这可能是该方对正常 脑的保健作用及治疗小儿脑瘫、老年性痴呆的重要机制之一。李氏5号方水提液对神经元游离钙浓度的影响@胡德辉!510515广州$南方医科大学生理学教研室
@常全忠$河南新乡医学院实验管理中心
@李生海$广东高明脑病医疗医药研究院
@高天明$河南新乡医学院神经生物学教研室目的观察李氏5号方水提液(LQET)对神经元游离 钙浓度的影响。方法取出生1天内的SD大鼠,分离培养海马神经元,用阿糖胞苷抑制胶质细胞生 长,细胞培养到第9~12天进行细胞内钙荧光测定。用荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞 45min,借助共聚焦显微镜钙成像技术测定在30mmol/L的KCl作用下,不同干扰因 素下培养的海马神经元胞浆游离钙荧光强度。结果正常条件下培养的神经元,细胞内游离钙浓度为 75.67±8.65nmol/L,LQET使细胞内游离钙浓度提高到126.35±9.3 5nmol/L,但仍在正常上限范围内;L-型钙通道阻断剂硝苯地平预处理24h,30mm ol/LKCl激活的细胞游离钙浓度降低到40.65±5.65nmol/L,与正常对照组 比较差异显著。LQET与硝苯地平共同预处理后细胞游离钙浓度降低到90.75±10.15 nmol/L,与单纯LQET预处理组和单纯硝苯地平组比较差异显著。10μmol/LNM DA能明显增加细胞内钙荧光强度,且能在某一强度稳定,NMDA受体阻断剂MK-801可显 著阻断这一效应。LQET预处理后,NMDA导致的胞浆钙荧光强度的增强效应明显降低,MK -801预处理后,LQET降低NMDA增强细胞内荧光的效应显著降低。结论LQET能通过 L-型钙通道和NMDA受体对神经元细胞内钙浓度进行双向调定。李氏5号方水提液;; 神经元;; 海马;;钙成像;; 游离钙1TakahashiA,Camacho P,Lechleiter JDet al.Measurement of intra-cellular calcium.Physiol Rev,1999,79(4):1089
2李子中.李氏5号治疗精神发育迟滞的疗效报告及其机制探讨.甘肃中医,1995,8(4):14
3王树山,李子中.脑力智宝治疗小儿脑瘫的疗效研究.美国中华医学杂志,2000,1(2):41
4李子中,魏堔.脑力智宝与脑复康治疗精神发育迟滞儿童的对照研究.中药药理与临床,1999,15(6):31
5张杰,徐列明.中药对钙离子及其通道的调控作用研究概况.上海中医药杂志,2003,37(10):54
6Katsube N,Sunaga K,Aishta Het al.Ono1603,a potential overex-pression of glyceraldehydes3phosphatedehydrogenase in cultured cen-tral nervous systemneurons.J Pharmarcol Exp Ther,1999,288(1):6
7El Idrissi A,Trenkner E.Growth factor and taurine protect against excitotoxicity by stabilizing calcium homeostasis and
More abstracts about the 李氏5号方水提液对神经元游离钙浓度的影响