正确评价药品检验中的不确定度是药物分析中的一个难点,有人对HPLC测定咖啡因的不确定度进 行了研究,但尚未见关于抗生素微生物检定法测定中含量不确定度的报道。本文以阿奇霉素标准品 的含量标定为例,对抗生素微生物检定法中的不确定度计算进行探讨研究,以提高数据分析和测定 结果的准确性和可信度。一、实验部分1.仪器与试剂ZY-300IV多功能微生物自动测量分 析仪(北京先驱威锋技术开发公司);BP-211D分析天平(瑞士Sartorius公司) ;电热隔水式恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);阿奇霉素标准品(中国药品生物制品检定所, 效价测定用,946μ/mg,批号:130352-200304)与阿奇霉素供试品(中国药 品生物制品检定所);Ⅰ号7.8～8.0培养基(批号—040212,北京三药科技开发公司 生产、中国药品生物制品检定所监制);
短小芽孢杆菌〔CMCC(B)63202〕(中国药品 生物制品检定所);磷酸二氢钾与磷酸氢二钾等试剂均为分析纯;水为去离子纯化水。2.
标准品 溶液与供试品溶液的制备(1)标准品溶液的制备:精密称取阿奇霉素标准品0.05285g, 加乙醇28mL使之溶解,再加灭菌水定量稀释至50mL,摇匀,得溶液为1000μ/mL。 精密吸取该溶液(1000μ/mL)5.0mL,用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释至50m L,摇匀,得溶液为100μ/mL;再分别精密吸取溶液(100μ/mL)5.0mL,分别 用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释至50mL与100mL,摇匀,得溶液分别为10μ/mL 与5μ/mL,作为标准品溶液的高、低剂量。(2)供试品溶液的制备:精密称取阿奇霉素供试 品0.05260g(估计效价950.6μ/mg),溶解与稀释同标准品溶液的制备,得溶液 分别为10μ/mL与5μ/mL,作为供试品溶液的高、低剂量。3.双碟的制备与培养取平底 双碟约10套(n),分别加入加热融化的培养基20mL,放置水平台上使凝固,作为底层。另 取加热融化后的培养基适量,放冷至50℃,加入短小芽孢杆菌的菌悬液适量,摇匀,在每一双碟 中分别加入5mL,摊布均匀,作为菌层。冷却后,在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管4(k )个,待用。将上述稀释好的标准品溶液与供试品溶液分别滴加于不锈钢小管内,在(35～37 )℃恒温培养箱中培养(16～18)小时。4.抑菌圈直径的测定与效价计算取出培养好的双碟,用抑菌圈测量仪测量各个抑菌圈的直径,照生物检定统计法(中国药典2005年版二部附录XIV中的2.2法)进行可靠性检验与效价计算。当可靠性检验结果为回归非常显著(P<0.01) 与偏离平行不显著(P>0.05)时,实验结果才成立。二、结果与讨论1.数学模型被测量是 供试品的效价,它取决于标准品的质量、表1抑菌圈测量的直径值(d)纯度与供试品的质量、标 准品溶液产生的直径、供试品溶液产生的直径。抑菌圈直径测定时,分别对10个双碟进行扫描测 定,测定结果见表1。效价由下式给出:y=ms×5mL×5mL50mL×100mL×50 mLmt×5mL×5mL50mL×100mL×50mL×log-〔10.301S02+ (TT22-+ST11--TS12-S1)〕式中,ms与mt分别为标准品与供试品的质量 ,5mL为移液管的体积,50mL与100mL均为容量瓶的体积。常数0.3010,由浓度 间的比率决定,与所用双碟数无关,因此,剂距为2∶1不变时,增加双碟数,常数0.3010 仍不变。S2为n个双碟高浓度标准品溶液所制的抑菌圈直径值的总和,S1为n个双碟低浓度标 准品溶液所制的抑菌圈直径值的总和;T2为n个双碟高浓度供试品溶液所制的抑菌圈直径值的总 和,T1为n个双碟低浓度供试品溶液所制的抑菌圈直径值的总和。除抑菌圈直径值引起的输入量 的标准不确定度外,不确定度还包括标准品和供试品的称重、标准品纯度、容量瓶体积、移液管体 积、抑菌圈测量仪等。这个合成的不确定度即为效价测定的不确定度。2.各分量的标准不确定度 (1)抑菌圈直径值的不确定度分量u(x1)对抑菌圈直径的数据进行统计分析,根据上述公式 计算效价(y)为934.2μ/mg,同时统计分析得自由度f=(k-1)(n-1)=27 ,其合并样本标准差即标准不确定度为:u(x1)=kn∑y2-k·∑〔∑k·y(nk() k〕-21-)n·(n∑-〔1)∑y(n)〕2+〔∑y〕2"="0.0253=0.15 9相对标准不确定度为:u(x1)rel=u(x1)/y=0.159/934.24=1. 70×10-4(2)抑菌圈测量仪的不确定度分量u(x2)u(x2)=0.02"3mm= 0.012mm抑菌圈测量仪的最大允许误差为±0.02mm,则区间半宽度aP=0.02m m,测量值落在该区间的概率分布为均匀分布,包含因子k="3,其标准不确定度为:移菌圈测 量仪的标准圈直径为19mm,其相对标准不确定度为:u(x2)rel=u(xx2)=0. 10912=0.00063(3)配制溶液的不确定度分量u(x3)①标准品溶液的不确定度 us(x3)a.定容体积V的标准不确定度uv,A级100.00mL单标线容量瓶的容量误 差允许±0.1mL,按三角分布考虑,取k="6,则标准不确定度=0.1/"6=0.04 mL,相对标准不确定度为0.04/100=0.0004。用A类方法评定,即通过对容量瓶 的重复实验可以估算定容变动产生的不确定度。液体的体积与其比重的乘积等于其重量,同一液体 的比重为常数,因此可以对典型的100mL容量瓶定容10次,并称量求取其标准偏差来评价其 容量配置的重复性。采用贝塞尔方法计算标准偏差,标准不确定度等于1倍标准偏差,用A级10 0.00mL容量瓶配制溶液,稀释至刻度线的度数,重复性引起的不确定度为0.04mL。配 置溶液时,水温接近20℃,因而温度的影响可忽略不计,则定容体积V的标准不确定度为:uv 1=0.042+0.042"=0.06mL,相对标准不确定度为:uv1rel=0.06 /100.00=0.0006。同样地,50.00mL容量瓶的标准不确定度与相对标准不确 定度分别为:uv2=0.05mL与uv2rel=0.0005。使用100.00mL容量 瓶1次与50.00mL容量瓶3次,因此定容体积的合成标准不确定度为:uνrel=uv1 rel2+3×uv2rel2"=0.00062+3×0.00052"=0.0011b. 移取溶液的不确定度分量uνyrel考虑到移取溶液体积量,认为移取溶液的不确定度来自于移 液管刻度的不确定度,根据规定,5mL移液管的最大允许误差为±0.015mL,按三角分布 考虑,取k="6,则u(x4)=0.015/"6=0.006mL。用A类方法评定,重复 性引起的不确定度为0.008mL。配置溶液时,水温接近20℃,因而温度的影响可忽略不计 ,使用移液管2次,则移取溶液的标准不确定度为:uv1=0.0062+0.0082"=0 .01mL,相对标准不确定度为:uνyrel=2×0.012"/5=0.0029。c. 标准品纯度引起的不确定度umc阿奇霉素标准品含量的标准不确定度为1%,取k="3,则u mcrel=umc/C=1%/("3×946)=6.10×10-4d.标准品质量的标准 不确定度um天平使用说明书给出的天平的分辨力为0.01mg,包含因子k="3,则天平的 不确定度um1=0.01×10-3/"3=5.8×10-6g天平使用说明书给出的天平的 重复性误差为0.02mg,认为服从矩形分布,包含因子k="3,则称量重复性不确定度um 2=0.02×10-3/(!3)=0.58mg=1.15×10-5g标准品质量的相对标 准不确定度umrel=um/0.05286=(5.8×10-6)2+(1.15×10- 5)2!/0.05286=0.00024合成标准品溶液的不确定度us(x3)us(x3 )=uvrel2+uvyrel2+umcrel2+umrel2!=0.00112+0. 00172+0.000612+0.000242!=0.0021②供试品溶液的不确定度u T(x3)同样计算:a.定容体积V的标准不确定度uνreluνrel=uv1rel2+ 3×uv2rel2!=0.00062+3×0.00052!=0.0011b.移取溶液的 不确定度分量uνyreluνyrel=2×0.012!/5=0.0029c.供试品质量 的标准不确定度um供试品质量的相对标准不确定度umrelumrel=um/0.0526 0=(5.8×10-6)2+(1.15×10-5)2!/0.05260=0.00024 合成供试品溶液的不确定度uT(x3)uT(x3)=umrel2+uvyrel2+umr el2!=0.00112+0.00172+0.000242!=0.0020因而配制溶液 的不确定度u(x3)rel=us(x3)2+uT(x3)2!3.总合成标准不确定度u( y)合成标准不确定度由抑菌圈直径值观测列的不确定度即A类不确定度u(x1)与B类不确定 度即移菌圈测量仪的标准不确定度u(x2)、配置溶液的不确定度u(x3)组成,它们是各自 独立的分量,因而可按方和根方式进行合成标准不确定度的计算:u(y)/y=u(x1)re l2+u(x2)rel2+u(x3)rel2!=0.0001712+0.000632+ 0.00292!=0.00304.扩展不确定度实验结果一般用扩展不确定度表示。u(y) /y=0.0030,y=934.24μ/mg,u(y)=0.0030×934.24μ/mg=2.80μ/mg。取包含因子k=2(置信概率约为95%),则扩展不确定度为U=2u(y)=2×2.80μ/mg=5.6μ/mg。阿奇霉素效价测定的结果可表示为:
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