膜联蛋白(Annexin)是一类钙依赖的磷脂酶结合蛋白。膜联蛋白A1是膜联蛋白家族中第一 个被描述的成员,维持单个核细胞(MNC)与内皮细胞黏附与去黏附的动态平衡〔1〕。动脉粥 样硬化(AS)发生发展的整个过程都有炎性因素的参与,炎细胞尤其是MNC与内皮细胞黏附并 迁移至内皮下演变为巨噬细胞是AS的关键环节之一〔2〕。近几年的研究发现,他汀类药物抗A S作用也与其抗炎作用有关〔3～6〕。在以上环节当中是否有膜联蛋白A1参与,国内外还未见 报道。本研究在体外分别用不同浓度氟伐他汀在不同时间与MNC共培养,研究了在AS发生发展 过程中重要的抗炎蛋白膜联蛋白A1的参与,旨在为氟伐他汀抗AS作用以及对AS的治疗提供新 的视点。1材料与方法1.1材料与仪器RPMI1640:美国Sigma公司。膜联蛋白A1单克隆抗体:美国BD公司。荧光抗体(IgGFITC):北京天来生物公司。Percoll液:Pharmax ia。氟伐他汀原粉:北京诺华制药有限公司。流式细胞仪(CoulterEpicsXL):美国Beckman Coulter公司。二氧化碳培养箱(MCO15AC):日本三洋公司。超净工作台(SW CT2FD):苏净集团安秦公司。1.2方法1.2.1细胞分离与培养取健康献血员静脉血50 ml采用Percoll(密度为1.077)密度梯度离心法分离收集MNC,置于RPMI1 640含10%人AB血清37℃,0.05CO2细胞培养箱中培养;Giemsa染色纯度9 0%以上,2%台盼蓝染色示细胞活力>95%。1.2.2实验设计将分离培养的MNC(细胞 密度调至2×109/L)分为:阴性对照组(PBS处理)、氟伐他汀标准品不同浓度处理组( 终浓度分别为0.2、0.4、0.8mg/L,处理时间为24h)、
氟伐他汀0.4mg/L 不同时间处理组(时间分别为2、8、16、24h)。各个不同处理因素样本数均为4。1.2 .3MNC中膜联蛋白A1表达水平检测按以上设计培养预定时间后收集MNC(调整细胞密度至 1×106/ml),2000r/min离心4min,弃上清。沉淀部分加Hank's液混 悬后再2000r/min离心4min,洗涤2遍弃上清,乙醇(终浓度为70%)固定10m in,加入破膜剂与细胞共育10min,Hank液冲洗2次;加小鼠抗人膜联蛋白A1单克隆 抗体100(1∶100稀释),4℃共育30min,Hank's液冲洗2次;再加入FIT C兔抗鼠IgG100μl(1∶8稀释),4℃共育30min,Hank液冲洗1次;流式细 胞仪检测,计数1×104个细胞,用平均荧光强度(MFI)代表膜联蛋白A1表达水平。同时 对各标本做阴性对照,PBS代替膜联蛋白A1单克隆抗体,操作同前。1.3统计学处理数据用 x±s表示,组间比较用t检验。2结果2.1氟伐他汀不同浓度对MNC中膜联蛋白A1表达水 平的影响0.2mg/L、0.4mg/L和0.8mg/L浓度氟伐他汀的MFI分别为3.2 950±0.09883、4.0225±0.19772和4.8000±0.08679,与 阴性对照组(2.4000±0.07348)比较,均差异有统计学意义(P<0.01)。2 .2氟伐他汀作用不同时间对MNC中膜联蛋白A1表达水平的影响氟伐他汀作用2h、8h、1 6h和24h后的MFL分别为4.2625±0.05560、4.2100±0.10360 、4.0900±0.06272和4.0225±0.19772,与阴性对照组(2.400 0±0.07348)比较,均差异有统计学意义(P<0.01)。3讨论膜联蛋白A1是一种 抗炎蛋白,广泛分布于人体组织包括MNC。其功能涉及细胞生命活动的各个方面,包括细胞分泌 、信号转导、炎症反应和细胞凋亡等。冠心病是一种炎性相关疾病,其主要病理过程是动脉粥样硬 化,MNC与内皮细胞的黏附是这一病理过程的启动环节。炎症反应参与这一过程尤其是急性冠脉 综合征的发生发展。在炎症反应中膜联蛋白A1对中性粒细胞和MNC迁移都有强大的抑制效应,这一作用与甲酰基肽受体(FPR)和lipoxinA4受体(ALXR)的激活、L选择素(Lselectin)的脱落、整合素(integrin)α4β1的竞争性结合和N聚糖羧化有关 〔7〕。当中性粒细胞/MNC黏附到血管内皮细胞时,膜联蛋白A1移动并且外化,外化的膜联 蛋白A1与介导白细胞内皮细胞相互作用的黏附分子相互作用,促进黏附的中性粒细胞/MNC从 内皮细胞上脱落,从而维持中性粒细胞/MNC与内皮细胞之间黏附与去黏附的动态平衡,调节其 血管外渗出水平〔8〕。整合素α4β1与内皮细胞表达的VCAM1相互作用介导中性粒细胞/ MNC的血管外迁移。Solito等〔9〕发现膜联蛋白A1与整合素α4β1共同定位于MN C表面。膜联蛋白A1和血管细胞黏附分子1(VCAM1)竞争与MNC系U937细胞上整合 素α4β1结合抑制其与内皮细胞黏附。在膜联蛋白A1对黏附分子的影响中,内源性膜联蛋白A 1诱导L选择素脱落是一关键环节〔10〕。另一类与抗迁移有关的物质是羧化N聚糖。羧化N聚 糖在内皮细胞上呈组成性表达,已有实验表明膜联蛋白A1能够结合这一聚糖,单克隆抗体对这些 聚糖功能的阻滞可以抑制鼠腹膜炎模型中中性粒细胞/MNC血管外迁移〔7〕。在膜联蛋白A1 基因剔除鼠模型中〔11〕,白细胞在其迁移行为、吞噬作用和表达黏附分子方面均发生异常。也 有研究表明膜联蛋白A1基因的缺失通过影响外周组织巨噬细胞表面黏附分子的表达选择性改变了 其吞噬能力〔12〕。多项研究均表明外源性膜联蛋白A1以及内源性膜联蛋白A1外化与VCA M1竞争与整合素α4β1结合,抑制MNC与血管内皮细胞的黏附,参与早期炎症反应的调节〔 9,10〕。他汀类药物抗炎、抗AS的作用是当前研究热点〔3～6〕。由于MNC和T淋巴细 胞在冠心病的发生发展中都起着举足轻重的作用,而且在这2类细胞中均有膜联蛋白A1表达,故 本研究选择MNC作为研究对象。为了紧密结合临床,本研究采用氟伐他汀临床使用剂量所能达到 的血药浓度为标准。研究发现,氟伐他汀可以影响外周血MNC抗炎蛋白膜联蛋白A1表达。随着 其剂量增加,膜联蛋白A1表达水平显著增加;氟伐他汀作用2h后,膜联蛋白A1水平达高峰。 膜联蛋白A1调节炎症的作用是肯定的,氟伐他汀抗炎作用机制正处于研究阶段。本研究结果表明 ,氟伐他汀可能通过调节外周血MNC中膜联蛋白A1表达水平的改变发挥抗炎作用,并进一步发 挥抗AS作用。这一结果为氟伐他汀抗炎,同时也为抗AS作用机制提供了新的线索。同时也为急 性冠状动脉综合征患者早期足量应用他汀类药物提供了理论依据。众所周知,他汀类药物的不良反 应限制了其应用。本研究也为开发新的抗炎制剂,新的心脏保护剂提供了新的视点。氟伐他汀对人外周血单个核细胞膜联蛋白A_1表达水平的影响@高奋堂$甘肃省人民医院心内科!兰州730000
@曹云山$甘肃省人民医院心内科!兰州730000
@徐义先$甘肃省人民医院心内科!兰州730000
@谢萍$甘肃省人民医院心内科!兰州730000目的:探讨氟伐他汀对人外周血单个核细胞(M NC)中抗炎蛋白膜联蛋白A1表达水平的影响,为氟伐他汀抗炎抗动脉粥样硬化机制提供新的视 点。方法:在体外分离培养人MNC,分别用不同浓度氟伐他汀(0.2、0.4、0.8mg/ L)诱导不同时间(2、8、16、24h)后,应用流式细胞仪检测MNC膜联蛋白A1表达水 平。结果:氟伐他汀可使MNC膜联蛋白A1表达上调(P<0.01),呈浓度、时间依赖方式 。阴性对照组平均荧光强度(MFI)2.4000,0.2mg/L组MFI3.2950,0 .4mg/L组4.0225,0.8mg/L组4.8000;2h组4.2625,8h组4 .2100,16h组4.0900,24h组4.0225。结论:氟伐他汀可以通过上调MN C膜联蛋白A1表达发挥抗炎、抗动脉粥样硬化作用。单个核细胞;;膜联蛋白A1;;氟伐他汀;;
炎症<1>GERKEV,MOSSSE.Annexin:fromstructuretofunction
.PhysioRev,2002,82:331-371.
<2>LANGHEINRICHAC,BOHLERM.Atheroscle rosis:humoralandcellularfactorsofinflammation.VirchowsArchiv,2005,446:101-111.
<3>SPARROWCP,BURTONCA,HERNANDEZM,etal.Simvastatinhasanti inflammatoryandanti ath eroscleroticactivitiesindependentofplasmacholester ollowering.ArteriosclerThrombVascBiol,2001,21:115-121.
<4>LIJJ,CHENXJ.Simvastatininhibitsinterleukin6releaseinhumanmonocytesstimulatedbyC reactive proteinaswellaslipopolysaccharide.CoronArtery Dis,2003,14:329-334.
<5>WANGHR,LIJJ,HUANGCX,etal.Fluvasta tininhibitstheexpressionoftumornecrosisfacto rαandactivationofnuclearfactorκBinhumanendothelialcellsstimulatedbyC rea
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