前言人甲状旁腺素是(human parathormone,PTH)是由甲状旁腺主细胞分泌并合成的。它是由84个氨基酸组成 的多肽,最初的转译产物是115个氨基酸残基的前甲状旁腺激素原(pre-prohPTH) ,在分泌过程中首先在粗面内质网膜周质腔被信号肽酶切除N端25个氨基酸的信号肽部分成为甲 状旁腺激素原(prohPTH),然后在高尔基体中切掉6个氨基酸的前体部分成为84肽成熟 激素<1>。而PTH发挥生物学活性不需要完整的分子。实验表明:PTH(1-27)仍保持 有一定体外活性,而PTH(1-26)则完全丧失体内、体外活性。hPTH(1-34)在体 内、外保持有完整PTH的几乎全部生物活性<2-4>。PTH的主要功能是调节钙、磷代谢, 使血钙升高,血磷降低<5>。研究表明,小剂量多次皮下注射PTH可刺激成骨细胞的增殖及骨 小梁的增长,不仅能使已丢失的松质骨重建,骨量明显增加,而且能改善骨强度,促进骨膜形成及 骨小梁连续性<6>。因此,它能很好的治疗骨质疏松,被誉为治疗骨质疏松的第二代首选药。本 实验室已成功构建了甲状旁腺素活性肽段N端1-34个氨基酸的表达载体,并将第11位突变为 精氨酸,使其达到更好的疗效。通过发酵表达融合蛋白,对包涵体进行分离纯化,酸水解得到目的 小肽,再经阳离子交换后冻干得到纯品。由于纯品在用反相柱进行高效液相色谱分析时,色谱图中 显示两个峰,本文将针对这一现象加以分析和讨论。1实验设备、试剂与方法1.1实验设备高效液相-质谱联用仪:Agilent1100 LC/MSD高效液相色谱仪:LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)SPD-10A紫外检测 器(日本岛津)UV-2100型紫外分光光度计(日本岛津)N-2000双通道色谱工作站(浙江大学)KTAExplorer 100蛋白质快速纯化系统(瑞典安玛西亚公司)1.2试剂乙腈(TEDIA公司),三氟乙酸( MERCK公司)甲酸、磷酸、醋酸和十二烷基硫酸钠(SDS)均为分析纯。水为2次蒸馏水。 1.3实验方法1.3.1使用反相柱对重组人甲状旁腺素相关肽进行高效液相色谱分析:色谱条件:反相柱为Shim-packCLC-ODS 6.0mmID×15cm,A相为0.1%的三氟乙酸水溶液,B相为纯乙腈,梯度为B相从20 %到70%,30mins,流速为1ml/min,检测波长为280nm,进样量为20ul ,温度为室温。1.3.2研究两个峰所代表的物质的性质1.3.2.1分析两个峰所代表物质 的疏水性:使用反相柱在无酸性离子对试剂的情况下进行高效液相色谱分析。色谱条件:反相柱为RESOURCERPC柱体积为3ml,A相为纯水,梯度为B相从5%到65%,60mins,其余与2.1的 色谱条件相同。1.3.2.2分析两个峰所代表物质的带电荷情况“使用离子交换柱进行高效液相色谱分析,树脂为SPSepharose FF。A相为40mM的醋酸-醋酸钠缓冲体系,pH5.0;B相为40mM的醋酸-醋酸钠缓冲+0.5M NaCl,pH5.0;梯度为B相从0到100%,90mins,流速为1ml/min,检测 波长:280nm,温度为室温。1.3.2.3分析两个峰所代表物质的分子量大小方法一:S DS-PAGE电泳,采用小肽电泳三层胶的方法。方法二:高效液相色谱法和质谱联用。色谱条 件:A相为0.2%甲酸水溶液,梯度为B相从10%到30%,其余与2.1的色谱条件相同。质谱条件:Scanm/z 105-2000,Fragmentor:100V,Drying GasFlow:10L/min,Nebulizer Pressure:40psi,Drying Gas Temperature:350℃,Capillary Voltage:4000V1.3.2.4截取峰尖后采用高效液相色谱法进行研究:截取前一个 峰的峰尖,冻干后再用反相柱进行高效液相色谱分析。色谱条件:均与2.1的色谱条件相同。1 .3.2.5研究两个峰所代表物质的构象:样品准备:将冻干粉溶于含8%SDS的水溶液中,在沸水域中煮5-10mins,让SDS充分与小肽结合。色谱条件:反相柱为RESOURCERPC柱体积为3ml,其余与2.1的色谱条件相同。2实验结果和分析2.1使用反相柱对人甲 状旁腺素相关肽进行高效液相色谱分析在室温下,将样品溶于溶液中,溶液由80%的A相和20 %的B相构成,采用三氟乙酸为离子对试剂增加样品的保留时间,对样品的分析结果如图1所示。图1Pro-Pro-
-hPTH(1-34)-Pro-Pro在280nm检测波长下的高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of Pro-Pro--hPTH(1-34)-Pro-Pro at A280nm.反相柱的高效液相色谱图结果显示,两个峰的保留时间分别为15.254min和 15.879min,相差0.625min,两峰的分离度为1.35。显然两峰没有得到很好 的分离。对于两峰是由同一种物质的两种构象形成的,还是两种物质形成的,我们进行了讨论。因 为它们的保留时间差值很小,做峰的切线与基线相交,两峰的面积有很大部分的重叠,所以初步推 测两峰所代表的物质有很相似的疏水性。2.2研究两个峰所代表的物质的性质2.2.1从疏水 性方面分析两个峰所代表的物质的性质:在不加酸性离子对试剂的情况下,样品溶于含20%乙腈 的水溶液中,室温下用反相柱进行高效液相色谱分析,如图2所示。图2无酸性离子对试剂时的Pro-Pro--hPTH(1-34)-Pro-Pro高效液相色谱图Fig2 HPLC chromatograms of Pro-Pro--hPTH(1-34)-Pro-Pro without acid ionic reagent色谱图显示一个单峰。这里是在中性条件下进行分析,A相中不含酸性离子对试剂, 因此推测,在有酸性离子对试剂存在时产生的两个峰,原因可能是同一种物质出现了两种构象。分 析认为,由于该小肽由34个氨基酸组成,可以形成高级构象,在酸性条件下,会影响氨基酸的电 离平衡,同时也减弱了氢键的稳定性,因此能够形成两种不同的疏水核心,并且使疏水氨基酸在小 肽外表面形成不同分布,因为反相柱的分离原理是根据树脂与分离物质间的疏水作用力差异来分离 的,因此可能由于样品产生了两种不同的高级构象,与树脂间的疏水作用力不同,造成色谱图上出 现两个峰;同时,在酸水解释放小肽后,小肽形成了部分折叠和完全折叠两种构象,也可能造成色 谱图上出现两个峰。但不可能是小肽形成了聚集体造成的,因为聚集体和单体的疏水性不会相同的 。这个结果也说明了该样品在中性体系条件下只形成一种构象,从高效液相色谱图中显示为单一物 质。2.2.2从带电荷方面分析两个峰所代表的物质的性质:将冻干的样品溶于水后,使用离子 交换柱进行高效液相色谱分析,由于样品是碱性的,所以溶解于水中的样品带正电荷,用阳离子交换树脂分析的结果如图3所示。图3Pro-Pro--hPTH(1-34)-Pro-Pro的离子交换柱的高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of ion-exchange column chromatography色谱图显示,呈现正态单峰。此法的pH值为5.0,是在弱酸条件 下分析的,可得到结论是,如果样品在此条件下形成了聚集体,或是样品不纯,不会呈现完全正态 分布的单峰;如果样品形成了两种构象,则两种构象表面分布的带电荷氨基酸数目就完全相等,此 种情况不大可能;推测可能在弱酸情况下,H+对氢键稳定性影响不大,只形成了一种构象,因此 呈现单峰。从离子交换的高效液相色谱图看重组人甲状旁腺素相关肽为单一物质。2.2.3从分 子量方面分析两个峰所代表的物质的性质:根据小肽电泳用三层胶的方法跑SDS-PAGE电泳,结果如图4所示。图4SDS-PAGE电泳分析Pro-Pro--hPTH(1-34)-Pro-Pro的电泳图Fig 4 SDS-PAGE analysis of Pro-Pro--hPTH(1-34)-Pro-Pro peptideLane1 Standard peptide marker,Lane2 Pure Pro-Pro--hPTH(1-34)-Pro-Pro peptide,Lane3 Insulin.SDS-PAGE电泳图显示单条带,证明样品达到了电泳纯。这里电泳缓冲液和 上样缓冲液均为碱性,也间接说明了,在反相柱的高效液相色谱分析中,酸性体系对样品结构有一 定的影响。得到的电泳单条带,完全可以说明反相柱的高效液相色谱图中两个峰代表的物质分子量 相等。在高效液相色谱-质谱联用中,因为三氟乙酸会减弱质谱中电荷峰的强度,因此在A相中加 了甲酸,将样品溶于含10%B相的流动相中,用反相柱进行高效液相色谱分析,液相色谱图和质 谱图如图5所示,对两个峰的分析结果如图6、图7所示。此法用了甲酸,仍然是在酸性条件下进 行高效液相色谱分析。液质联用分析得到的两峰分子量分别为4548.59Da和4548.6 4Da,证明了分子量相等。再根据分子离子峰给出的信息,第一个峰为:569.5、650. 8、759.0、910.7和1137.8,第二个峰为569.5、650.8、759.0 、910.7和1137.8,比较得出,分子离子峰一致。如果两个峰为两个不同的物质,它们 的分子离子峰不会完全一致。两种物质分子量相等的几率很低,分子离子峰完全一致的几率更是极 低。此外,我们将小肽样品直接做质谱分析,计算得到的分子量为4548.66Da,且分子离子峰为569.5、650.8、759.0、910.7
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