齐多夫定(zid()vu(line，AZT)是胸营类似物，是 第1个被获准治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的 药物，于1987年被美国FDA批准上市，并且是唯一 被FDA核准预防HIV一!母婴传播的药物!‘21。测定 血浆中齐多夫定的方法已有很多报道，包括放射免 疫法}’{、HPLC一UVI牛6怯文献<7，8>报道采用液相色 谱一质i普一质谱联用法用于艾滋病人联合用药后，同 时监测体内多种抗HIV病毒药物的血药浓度，由于 病人长期联合用药，测定高浓度血浆样品对方法灵 敏度要求不高，且分析过程中分离方法复杂本研究 拟建立一种快速、灵敏的液相色谱一串联质谱(LC/ MS/MS)法，测定健康受试者服用低剂量齐多夫定后 血浆中的浓度，并用于评价制剂的生物等效性。 材料与方法 药品与试剂齐多夫定(纯度99.7%)和内标司他 夫定对照品(纯度96.9%)由东北制药总厂研究 院提供;齐多夫定片(东北制药总厂提供，每片 200 mg，批号20030801);齐多夫定胶囊(商品名 Retrovi‘·，Glax()Well(:onle Ine.生产，每粒200 mg，批 号IZP22O7);甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯; 空白血浆由沈阳中心血站提供。 仪器美国Thermo Finnigan公司TSQ Quantum Ultl’a型LC/MS/MS联用仪，配有电喷雾离子源 (Esl)以及XCalibtlr 1 .4数据处理系统;日本岛津公 司LC一10 AD高效液相色谱输液泵，SIL一HT型自动 进样器。 色谱条件Zorbax Ex*endC，8柱，1 50 mm x 4.6 mm， 5林m，美国安捷伦公司;流动相为甲醇一水(70:30，用 l%氨水调节pH值至6.0);流速为0.5 mL·min一，; 进样量为20林L;柱温为室温。 质谱条件ESI源电压40 kV;加热毛细管温度 300℃;鞘气N:压力0.4 MPa;辅助气N:流量为 1.8 L.min一，;碰撞气(Ar)压力0.13Pa。碰撞诱导解离 (CID)电压分别为25 eV(齐多夫定)和22 eV(司他 夫定);正离子方式检测;扫描方式为选择反应监测 (SRM)，用于定量分析的离子反应分别为齐多夫定 m/z 268斗m/z 127和内标司他夫定m众225升m众 127;扫描时间为0.35。 血浆样品处理取血浆0.25 mL置于10 mL带塞 试管中，依次加入流动相50卜L，内标溶液(司他夫 定Zmg·L一，)50林L和磷酸盐缓冲液(5 ommol·L一，， pll6)250林L，混匀:加乙醚一二氯甲烷(3:2，v八) 3ml，涡流混合lmin，往复振荡IOmin，离心 (2 000 Xg)5 min，分取上层有机相于另一试管中， 40℃空气流下吹干，残留物加人150卜L流动相，涡 流溶解，取20卜L进行LC/MS/MS分析。 生物等效性及药动学研究本试验采用双周期交 叉试验。试验方案经医学伦理委员会批准，选择18 名健康男性受试者，年龄为19~23a，身高为160- 186 Cm，体重在标准体重的士ro%之内，于试验前签 署知情同意书后，随机分为甲、乙2组，每组9人。 受试者于试验前一日晚餐后禁食，试验日清晨空腹 给药，第1周期甲组口服受试制剂1片(相当于齐 多夫定200 mg)，乙组口服参比制剂1粒(相当于齐 多夫定200 mg);第2周期甲组口服参比制剂l粒， 乙组口服受试制剂1片。每次试验间隔为1 wk。医 生同时进行严格的临床监护，以保证受试者的安 全。于服药前(Oh)和服药后0.25，0.50，0.75，1.0， 15，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和8.Oh由前臂静脉取血 4mL，分离血浆，一20℃保存待测。临床试验在辽宁 省人民医院进行。 未知血浆样品测定按“血浆样品处理”项下操 作，每日建立l条标准曲线，同时分析低、中、高(双 样本)的质控(QC)样品，根据当日标准曲线求算未 知样品浓度和QC样品浓度，决定当日数据的取舍 方法的选择性分别取6名受试者的服药前血浆 0.25 mL，按“血浆样品处理”项下操作(不加内标溶 液)，进样20卜L，得色谱图，如图ZA;将一定浓度的 齐多夫定对照溶液和内标溶液加人空白血浆中，依 同法操作，得色谱图，如图ZB，齐多夫定和内标的 保留时间分别为3.2 min和2.9 min;取受试者口服 给药后的血浆样品，依同法操作，得色谱图，如图 ZC。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰齐 多夫定和内标的测定。见图2。 卜RMz，J/二225一127 洲1.:I《)()卜:4 51谧M 21了/:268一卜127 NI:】〔)〔)E3 结果 产节，军千千节钾胃币二研节气节吕吕月吕声吕片甲台片书片二带弓钾节二 ().()0一.()15 2.f)2.5 3.()3.5 I/万1 111- 2_sc)， 质谱分析本方法采用正离子方式检测，在一级全 扫描质谱图中获得齐多夫定的准分子离子峰m众 268，司他夫定的准分子离子峰m众225，选择性对 !M十HJ卜进行二级质谱分析(图1)，齐多夫定及内标 生成的主要碎片离子均为m几127，用于SRM扫描 时监测的产物离子。见图1。 SR Ml了I/之225~127 、I:47引.:4 3 .23n 51亏M，I护/:268争127 NI:5 .821:2 1 273 f)月().药 《; 10卜5 20 25 3.〔)3.5 2 .91. SRM夕，z/之225~1 27 入l:425!;4 明橄7(研所取下 拼、州一心冬三军 10叨 ，杯甲 1〔)() 163，5 575 育 毕瑞彩毕 !502〔)0 ”l/z 241.2 ~浑{ 25() 3 147 3又9一2 ︸ 324.11 2(1 l()0 3f)()35() }27.()6 SRMllJ众268个】27 N丁‘4.(耳f.:5 护’27 0刀().51_0卜5 ZJ)2.53〔)3.5 以叭川7( 6伙月〔) 00()0 八叹4，、 进目裂一丫一一冷 1 10.】」 、}。，(}{ 1 65兀)5 21〔)3(〕 .1毛只184 245.232，5.49 图2测定血浆中齐多夫定和内标司他夫定的典型SRM色 谱图A:空白血浆;B:空白血浆中加人齐多夫定至1.0四· U和内标司他夫定至400协g一l;C:一名受试者日服200川琶齐多 夫定a75h的血浆样品;峰I:内标;峰fl:齐多夫定 j‘)()1 50，映2〔)0 25〔)300 旧闷碑5() 图1齐多夫定(A)和内标司他夫定(B)
进行回 归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。典型 的回归方程为少=8.345xl0一3x+1.864对。一，，:= 0.9957齐多夫定的线性范围为10一2 500林g·L一，。 取空白血浆0.25 mL，加人齐多夫定5.0林g·L一‘ 标准溶液50林L，配制成相当于齐多夫定血浆浓度 为1.0林g·L，的样品，该样品在方法确证d3进行6 样本分析，并根据当日标准曲线计算每一样本测定 浓度，求得该浓度下齐多夫定的日内精密度(RSD) 为8.7%;准确度(RE)为一3.9%。该结果表明LC/ MS/MS法测定血浆中齐多夫定的定量下限可达 1·0林g’Lll>()l。 精密度与准确度取空白血浆0.25 mL，按“标准曲 线”项下的方法制备低、中、高3个浓度(齐多夫定 血浆浓度分别为2.5，50，2 000林g·L一，)的质量控制 (QC)样品，每一浓度进行6样本分析，测定3d，根 据当日的标准曲线，计算QC样品的测得浓度，将 QC样品的结果进行方差分析，计算本法的准确度 与精密度，结果见表1。在3个浓度下，齐多夫定的 日内精密度(RSD)小于7.8%;日间精密度(RSD)小 于7.2%;准确度(RE)在士2，8%之内。 样品，以提取后的色谱峰面积与未经提取获得的色 谱峰面积之比，考察样品的提取回收率，每一浓度 进行6样本分析。3种浓度下样品的提取回收率分 别为(52.2土、2.4)%，(53.3士2.2)%和(52.0士 2.4)%。内标溶液经同样提取处理，其回收率为 (62士3)%。 本研究考察了预处理后齐多夫定血浆样品室 温放置24h的稳定性。取空白血浆0.25 mL，配制 齐多夫定低、高2个浓度的血浆样品(齐多夫定浓 度分别为2.5和2000卜g·L一‘)，每一浓度进行3样 本分析，采用LC/MS/MS法测定。结果表
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