甜菜碱(Betaine)化学名称是三甲基铵乙丙酯(C5H11NO2),系甘氨酸的三甲基衍 生物。最早从甜菜中分离,是一种广泛分布于动植物组织中的季铵型水溶性生物碱<1>,是人体 惟一可替代叶酸或S-腺苷蛋氨酸作为甲基供体、参与蛋氨酸循环及卵磷脂合成的物质<2>,是 枸杞、怀牛膝、肉苁蓉等多种传统中药的重要活性成分。据文献报道,甜菜碱具有促进脂肪代谢、 抗脂肪肝、保护肾脏、降压、缓和应激、增进食欲、稳定维生素等多种药理作用<3>。作为生物 刺激剂,甜菜碱可促进家畜生长,增加产蛋量;作为两性表面活性剂、保湿剂、食品添加剂、防腐 剂等,也广泛用于化工、食品等行业。通过测定人体内组织或排泄物中的甜菜碱含量,还有助于临 床诊断人体的代谢异常<1-3>。另外,由于甜菜碱化学性质稳定且不易人为添加,测定它的含 量还可为含有甜菜碱的制剂提供可行的质控方法。1甜菜碱的提取分离1.1提取甜菜碱的结晶呈 鳞状或棱状,易吸潮,加热至310℃左右分解,味甜,极易溶于水,易溶于甲醇,溶于乙醇,难 溶于乙醚,经浓氢氧化钾溶液的分解反应可生成三甲胺。利用它这些物理性质,提取方法大多可概 括为水提和醇提两种,即溶于水或甲醇、乙醇溶剂。甜菜碱的溶解性很好,在乙醇溶液中,平均提 取率为99.8%,且与乙醇的浓度无关<4>,在不同浓度的乙醇溶液中均有良好的贮藏稳定性 。但由于不同物质含有的其他成分各不相同,故对水和醇的选择各不相同,醇浓度也有所不同。田 玉顺等<5>认为,从杞菊地黄丸中提取甜菜碱时用水比用乙醇效果好,可节省时间,还可以提高 甜菜碱在柱上的吸附能力。人们大多选择95%的乙醇作为提取溶剂,刘卫东等<6>考虑到肉苁 蓉中含有大量多糖,不易用水和低浓度乙醇提取,以免糊化,为此选择70%乙醇作为提取溶剂。 另外,含甜菜碱的物质化学性质各不相同,方法也略有差别。如杨东辉等<7>用七种不同的方法 提取枸杞子浸膏中的甜菜碱,结果比较发现水提-石醇法(用水煎煮制成浸膏,用石灰粉调pH1 2,然后加95%乙醇再制成浸膏)是枸杞浸膏中甜菜碱的最佳提取工艺。张波等<8>采用絮凝 工艺处理肉苁蓉水提液,结果发现絮凝法所得甜菜碱含量比醇沉法至少多25%,且测得聚凝净加 入量以0.2%~0.3%为宜。1.2分离1.2.1薄层层析法该法是以涂布于支持板上的支 持物作为固定相,以合适的溶剂作为流动相,对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种色谱分离技 术。对于甜菜碱的分离,薄层板多选用0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G预制板;展开剂 可多样,如丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)、甲醇-水(1∶1)pH5等;显色剂为改 良碘化铋钾试剂。用此法,杨东辉等<7>从枸杞浸膏中分离出甜菜碱。1.2.2离子交换法该 方法是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同,经过交换 平衡达到分离目的的一种柱色谱法。该法灵敏度高、重复性好、选择性好、分析速度快,是目前最 常用的方法之一。用该种方法提取甜菜碱的报道较多,刘新亚等<9>用200mL体积的强酸性 苯乙烯系<732型>阳离子交换树脂柱和200mL体积的强碱性阴离子交换树脂<717型> 柱配合,中间用300mL的氨水洗脱,流出液用100mL体积的活性炭柱脱色,分离出糖蜜中 的甜菜碱。另外,有用此法分离出大麦、鹿草属Thinopyrum草叶中甜菜碱的报道<1> 。另外,离子交换法提取分离出甜菜碱后,用紫外标记增加其吸光度,会大大提高检测灵敏度;有 将甜菜碱用14C进行标记的报道<10>。2甜菜碱的含量测定2.1光谱法主要采用光谱法中 的可见分光光度法,该法简便、快速、灵敏,且杂质含量少,分离效果好,通过线性化范围试验、 加样回收率测定、稳定性试验等,都证明该方法结果稳定,切实可行。该方法主要利用样品与显色 剂发生显色反应,变成有色物质,使之能用可见分光光度法测定:将甜菜碱与雷氏盐(硫氰化铬铵 )在酸性条件下反应,制成雷氏盐沉淀,并用700ml/L丙酮溶解,呈粉红色,在525nm 处以丙酮作空白对照,测得吸光度标准曲线,然后利用该标准曲线测定被检物中甜菜碱含量。包文 芳<11>等用此法测定了糖蜜中的甜菜碱含量。Valdes等<12>用此法在526nm处 测定了鱼食中甜菜碱的含量。朱桂花等<13>用此法在525nm处测定了枸杞半成品饮料中的 甜菜碱含量,并应用活性炭脱色法进行了测定前处理,使样品中的干扰成分得以有效去除,使测定 精确度得到提高。汤明辉等<14>不但用此法测定了地骨皮醇提物中的甜菜碱含量,并对滤液法 与沉淀法进行了比较:沉淀法系直接测定生物碱与雷氏盐反应所得沉淀的吸光度,比较直观;滤液 法则测定反应后去除沉淀的滤液吸光度,由空白试液的吸光度减去供试品的吸光度而间接得到生物 碱沉淀的吸光度。两法所得结果基本一致,沉淀法需用乙醚洗涤沉淀,滤液法操作相对简便。另外 ,也可将甜菜碱制成碘化物在紫外区进行吸光度测定,但该方法干扰因素较多,并且对甜菜碱含量 少的被检物敏感度低,应用该法效果不佳<1>。2.2薄层色谱扫描法该法具有快速、灵敏、高 选择、显色方便、重现性好等优点。多采用双波长扫描法,能消除有机成分的干扰及操作误差,使 测定的灵敏度和精确度显著提高。多用甲醇、正丁醇提取样品,以不同比例的氯仿-甲醇-水或其 他展开剂在硅胶薄层板上展开,用改良碘化铋钾试剂显色后进行扫描测定。杨东辉等<7>测定枸 杞浸膏中甜菜碱的含量,薄层扫描仪为岛津CS-9000,其参比波长600nm,样品波长5 10nm,狭缝1.2mm×1.2mm。王隶书等<15>测定了糖蜜酒渣中甜菜碱的含量,薄 层扫描仪为岛津CS-930,其参比波长513nm,样品波长460nm,扫描速度20mm /min,扫描方式为反射式锯齿扫描。杨云等<16>测定了五子衍宗丸中甜菜碱的含量,薄层 扫描仪为岛津CS-9301,其参比波长514nm,样品波长468nm,狭缝1.2mm× 1.2mm,扫描方式为反射式锯齿扫描。薄层扫描法具有分离和测定功能,运用较多。实际工作 中,层析过程常会出现拖尾现象,分离效果不佳。色谱条件要求尽可能保持恒定,在实际操作中, 展开时的温度、展开剂的蒸汽饱和度、展开剂的极性都会影响色谱条件的恒定,从而影响分离效果 和方法的重现性。2.3高效液相色谱法该方法兼具分离和分析功能,随着该方法使用的日益广泛 ,并且其流动相可选择性范围宽,色谱柱可反复使用,该方法已逐渐成为一种首选的分离分析方法 。过去,有用此方法分析糖蜜中、热带草和热带豆类中、兔肾髓溶质中的甜菜碱的报道<1>。但 由于甜菜碱结构中无共轭体系,仅能用折射仪检测或在低紫外吸收波长处(190~220nm) 测定,条件要求较高,且灵敏度或选择性均不够理想。于是人们研究将甜菜碱制成衍生物,再进行 高效液相色谱(HPLC)测定。杨昕等<10>用此法测定了4种海藻中甜菜碱的含量。他们用 离子交换法提取海藻中的甜菜碱,并制成4-溴代苯甲酰甲基溴的衍生物,使其在254nm处具 有紫外吸收。采用SCX强酸性阳离子交换色谱柱,以乙腈-水(90∶10v/v),10mm ol/L胆碱为流动相,以20μL的进样量,1.5mL/min的流速测定。陈树和等<17 >在对龟鹿二仙膏的质量标准进行研究时,选择甜菜碱为含量测定指标,也用到了2,4-溴代苯 甲酰甲基溴作为衍生试液,检测波长为254nm。2.4酸碱滴定法甜菜碱的结构式为(CH3 )3N+CH2COO-,根据其结构特征,通过测定其总含氮量可以测定其含量。该方法不需要 贵重精密仪器,实验操作简便,尤其适合于中小型企业的产品质量分析。杨宫娥等<18>测定了 合成甜菜碱中甜菜碱的含量,对此类方法做了初探:先将其完全溶于浓硫酸(18.4mol/L )、重铬酸钾制得硫酸铵,再蒸尽由后者分解的氨气并使其通过过量的稀硫酸(0.1mol/L )中和,最后用氢氧化钠(0.1mol/L)滴定过量的硫酸,反滴定过量酸时以甲基红作为指 示剂,滴定终点在pH=5~6的变色范围之内,根据吸收所用稀硫酸的总量以及反滴定所用氢氧 化钠的总量计算甜菜碱含量,结果已知含量和理论含量相接近,说明本方法可信。但测定方法不很 成熟,尚待进一步研究。同样,齐永秀等<3>以冰醋酸作为溶媒,以结晶紫作为指示剂,用0. 1mol/L标准高氯酸溶液滴定了盐酸甜菜碱中甜菜碱的含量:平均回收率为99.81%,相 对标准偏差(RSD)为0.19%。张立木等<19>先用碱化双相萃取处理枸杞子,再以0. 2%的结晶紫作为指示剂,用0.01mol/L标准高氯酸溶液滴定了宁夏枸杞子和内蒙枸杞子 中甜菜碱的含量,平均回收率为99.06%,进一步证明了此类方法的稳定性、重现性。2.5 重量法该方法是在酸性介质中将样品做成一种四苯硼钠的衍生物,通过调节pH而析出沉淀,即将 样品溶于甲醇、乙醇过滤,滤液蒸干后再加水溶解,加醋酸,再缓慢加入四苯硼钠和三氯化铝,过 滤,滤液加适量的饱和草酸溶液,过滤,用醋酸洗涤,干燥3h后称重。甜菜碱的含量%=26. 8×甜菜碱的含量%=26.8×WB((样沉品淀重重量量))。该方法已成功用于糖蜜、酒糟 中甜菜碱的测定,是一种较精确的方法<20>。2.6微型电极法该法以甘汞电极为参比电极, 玻璃微型电极为测定电极,用双静电计记录电压的方法测定甜菜碱含量。在高离子强度和低pH条 件下用此法测定,响应快,灵敏性好,适合混合物中甜菜碱含量较少的微量测定。国外有人用此法 测定了甲基胺混合物中甜菜碱的含量<1>。此外,还有关于质谱法、磁共振法的报道<1>。随着对甜菜碱了解的不断深入,它在各领域的应用也日益广泛。对甜菜碱的研究方法多种多样,且对于不同物质中甜菜碱的处理方法也各不相同。行之有效的提取、分离及含量测定方法,可以使该化合物得到更合理的利用,而较全面、稳定、成熟的方法尚待进一步研究。甜菜碱的提取分离及测定
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