膝关节骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性关节疾病,关节软骨 的退变是其发病的根本原因<1>,其主要症状是膝关节疼痛、肿胀、畸形和功能障碍等。随着社会人口老龄化,OA的发生日益增多。骨碎补是水龙骨科植物槲厥(Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.)的根茎,性温,味苦,归肝、肾经,具有补肾坚骨、 活血止痛的功效,临床主要用于肾虚腰脊疼痛、下肢痿弱、耳鸣耳聋等。已有文献报道骨碎补对实 验性骨关节炎有较好的治疗作用<2>,而总黄酮是骨碎补中的有效成分,具有良好的抗炎作用< 3>。本实验观察了骨碎补总黄酮对实验性膝骨关节炎的影响,为临床治疗骨关节炎提供依据。1 材料1·1药物及试剂骨碎补总黄酮:褐色粉末,由中国药科大学天然药物教研室楼凤昌教授提供 ,含量80%(芦丁比色法);壮骨关节丸(ZGGJW):三九医药股份有限公司;木瓜蛋白酶:北京奥博星生物技术责任有限公司。1·2实验动物雄性白色家兔,体重2·0~2·4kg,由南京安立默科技有限公司提供。许可证号为:SCXK(苏)2002-0002。SD雄性大鼠,体重200~230 g,由东南大学实验动物中心提供。许可证号为:SCXK(苏)2002-0014。2方法与结 果2·1骨碎补总黄酮对兔膝骨关节炎模型的影响分组及剂量设计:取48只家兔,按体重随机分 为6组,即:正常对照组,模型对照组,阳性对照组(壮骨关节丸),骨碎补总黄酮高、中、低剂量组。阳性对照组:称取适量壮骨关节丸,研碎,用0·5%CMC-Na配成0·1g·mL-1的悬液,灌胃给药,给药剂量为0·6 g·kg-1;骨碎补总黄酮组:称取适量骨碎补总黄酮,用蒸馏水配成所需溶液,高、中、低剂量组给药剂量分别为108、54、27 mg·kg-1;正常对照及模型对照组给予蒸馏水6 mL·kg-1。2·1·1造模方法按照文献<4>兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎病变模型,将家兔右膝关节腔内注入1·6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0·5 mL,隔3 d再注射第2次。2·1·2实验步骤家兔正常饲养1周后,模型对照组、阳性对照组(壮骨关节丸 )、骨碎补总黄酮高、中、低剂量组造模。在造模的同时灌胃给药。连续给药8周后,将各组家兔 放血处死,取下右膝关节,10%福尔马林溶液固定,然后切取股骨内髁软骨后,作HE染色,光镜下观察。按Mankin骨关中国天然药物2006年5月第4卷第3期ChinJ Nat Med May 2006 Vol·4 No·3 21 5节病组织学分类方法对软骨进行评分<5>:表层软骨细胞分裂增生正常、轻度增生、中度增生、 明显增生分别记为0、1、2、3分;细胞排列正常、排列稍乱但层次可分、排列不规则且层次紊 乱、严重紊乱分别记为0、1、2、3分。病理观察结果用x±s表示,显著性比较用t检验。结果见表1。Table1 Effect of total flavonoids on cartilage pathologicalscore of knee osteoarthritis in rabbits(n=8,x±s)Group Dose(mg·kg-1)Pathological scoreNormal 0·1±0·4Model 3·6±0·9ΔΔZGGJW 600 2·0±0·8**Total flavonoids 108 1·9±0·8**Total flavonoids 54 2·0±1·1**Total flavonoids 27 2·4±1·1*ΔΔP<0·01vsnormal;*P<0·05,**P<0·01vsm odel木瓜蛋白酶关节腔内注射8周后,模型对照组关节囊滑膜组织不完整,滑膜上皮细胞增生 肥大(++~+++),纤维膜清晰可见,囊腔内未可见渗出物,滑膜、滑膜下组织见大量炎细胞 浸润(+++),软骨表层细胞轻度增生(+),软骨细胞排列紊乱(+),无血管嵴生成。正常 组关节囊滑膜组织完好,滑膜上皮细胞被覆完整,纤维膜清晰可见,囊腔内未见渗出物,滑膜、滑 膜下组织未见炎细胞浸润。模型对照组和正常组软骨病变积分存在显著差异(P<0·01)。高 剂量组关节囊滑膜组织较完整,滑膜上皮细胞少量坏死脱落(+),纤维膜清晰可见,囊腔内未可 见渗出物,滑膜、滑膜下组织见炎细胞浸润(+),软骨表层细胞无增生,软骨细胞排列整齐,无 血管嵴生成,形态学优于模型对照组(图1)。高、中、低剂量组用药后病变均显著减轻,积分显著降低(P<0·01,P<0·05)。A:Normal;B:Model;C:ZGGJW;D:Groupof 108 mg·kg-1;E:Group of 54 mg·kg-1;F:Group of 27 mg·kg-1Fig 1 Effect of total flavonoids on the histopathology of cartilage in rabbits(×100)2·2骨碎补总黄酮对大鼠膝骨关节炎的影响分组及剂量设计:取60 只大鼠,按体重随机分为6组,每组10只,即:假手术组,模型对照组,阳性对照组(壮骨关节 丸),骨碎补总黄酮高、中、低剂量组。阳性对照组:称取适量壮骨关节丸,研碎,用0·5%CMC-Na配成0·12g·mL-1的悬液,灌胃给药,给药剂量为1·2 g·kg-1;骨碎补总黄酮组:称取适量骨碎补总黄酮,用蒸馏水配成所需溶液,高、中、低剂量组给药剂量分别为216、108、54 mg·kg-1;假手术及模型对照组给予蒸馏水1 mL·100 g-1。采用股静脉结扎法制备骨关节炎模型<6>。大鼠乙醚麻醉,于无菌条件下垂直腹股沟切口 ,分离出股静脉,做双重结扎,缝合皮肤。术后分笼饲养。假手术组找到股静脉后不予结扎,缝合 切口。4周起开始给药。每天灌胃给药1次,共给药8周。于术后12周处死取材,取左膝关节, 固定于10%福尔马林溶液,进行组织病理学检查,按Mankin法对软骨进行评分(见表2)。216Chin J Nat Med May 2006 Vol·4 No·3中国天然药物2006年5月第4卷第3期Table 2 Effect of total flavonoids on cartilage pathologicalscore of knee osteoarthritis in rats(n=8,x±s)Group Dose(mg·kg-1)Pathological scoreNormal 0·3±0·5Model 3·5±1·3ΔΔZGGJW 1 200 1·7±1·2**Total flavonoids 216 1·8±1·1**Total flavonoids 108 2·3±1·2*Total flavonoids 54 3·0±1·1ΔΔP<0·01vsnormal;*P<0·05,**P<0·01vsmo del另取右股骨外髁,先用生理盐水冲净表面血液、关节液及碎屑等,用2%的戊二醛固定,4℃下保存24h,0·1 mol·L-1PBS清洗,以1%四氧化锇固定2 h。再以0·1 mol·L-1PBS漂洗,乙醇逐级脱水,丙酮-醋酸异戊酯置换,液态二氧化碳临界点干燥,粘 台,镀金,于SX-40扫描电镜下观察。模型对照组软骨表层细胞增生,排列紊乱,关节软骨出 现退行性病变。模型对照组和假手术组软骨病变积分存在显著差异(P<0·01)。高、中剂量 组病变减轻,软骨病变积分显著降低(P<0·01,P<0·05)。高剂量组与阳性对照组比 较,软骨病变积分无统计学差异(P>0·05)。扫描电镜检测结果表明,模型组无定形物质有 所缺损,表面有胶原暴露,排列较不整齐,软骨面胶原集合成粗枝状,并翻起出现裂缝。骨碎补总 黄酮高、中剂量组软骨表面光滑,似覆盖一层无定形物质,垄形结构较平行,无定形物质有少量缺 损,有少量胶原暴露,与模型组相比有明显改善。结果见图2。A:Normal;B:Model;C:ZGGJW;D:Groupof 216 mg·kg-1;E:Group of 108 mg·kg-1;F:Group of 54 mg·kg-1Fig 2 Effect of total flavonoids on the ultrastructural pathology of cartilage in rats using scanning electron microscope(×5 000)3讨论关节具有运动及负重的功能,关节软骨必须光滑、平整而且有一定弹性,这些都需要 关节软骨的特殊生化成分和组织结构维持正常状态。关节软骨由软骨细胞和软骨基质组成,基质由 胶原网架及包含在网架中的蛋白聚糖大分子组成。蛋白聚糖具有吸收水分并保持水分的特性,从而 使胶原网架能维持其形态,使关节软骨可以发挥其既有弹性,又能负重的功能。在骨关节炎中,蛋 白聚糖颗粒变小且不成熟,降解增加,同时各种降解性酶对软骨细胞外基质的降解增强,造成软骨 面光滑平整情况的丧失,加上关节活动及负重等机械因素的影响,使骨关节炎病变不断加重<7, 8>。采用家兔关节内注射木瓜蛋白酶及大鼠结扎双侧静脉的方法造模,结果显示模型组软骨正常 结构消失,软骨表面出现裂缝甚至部分缺失,证实成功制备膝骨关节炎模型。两模型中,骨碎补总 黄酮可显著降低Mankin法软骨评分,减轻软骨病变;扫描电镜示骨碎补总黄酮组软骨表面光滑,似覆盖一层中国天然药物2006年5月第4卷第3期ChinJ Nat Med May 2006 Vol·4 No·3 21 7无定形物质,垄形结构较平行,与模型组相比有明显改善。以上结果表明骨碎补总黄酮具有较强的抗膝骨关节炎作用,在细胞和分子水平上还有待于进一步研究。骨碎补总黄酮的抗膝骨
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