板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indig-oticaFort·的干燥根<1>,其性寒味苦,有清热解毒、凉血利咽的功效。 目前板蓝根的质量控制尚无行之有效的评价指标,《中国药典》2005年版板蓝根项下以精氨酸 的薄层检识为定性依据,没有明确的与药效相关的质控成分<2>。现代研究表明,中药材的清热 解毒功效主要集中于其有效成分的抗内毒素作用和抗病原微生物作用。药理试验已证实<3,4> ,板蓝根中有机酸类成分具有明显的抗菌、抗内毒素作用。有报道以电位滴定法<5>测定总有机 酸含量,毛细管电泳法<6>测定单体成分的含量。酸碱滴定法、高效液色谱法作为有机酸类成分 分析的常用手段,简便、快捷、普适性强。本研究对板蓝根中有机酸类成分进行分析,采用酸碱滴 定法测定总有机酸含量,反相高效液色谱法测定板蓝根提取物中水杨酸含量,以期为板蓝根提取物 质量控制提供依据。1仪器与试剂Agilent高效液相色谱仪(在线真空脱气机、四元梯度泵、DAD检测器、化学工作站);AE163型电子分析天平;25mL碱式滴定管。水杨酸对照品(中国药品生物制品检定所);酚酞指示剂(北京芳草医药化工研制 公司);水杨酸(北京化学试剂公司);甲醇、乙腈为色谱纯;水为重蒸水;其他试剂均为分析纯 ;实验药材由解放军302医院中药房提供。2方法与结果2·1样品制备取板蓝根药材加10倍量75%乙醇浸泡12h,回流提取2次,每次2 h,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度1·05(60℃),浓盐酸调pH至2~3,用醋酸乙 酯萃取3次,少量水洗醋酸乙酯层,减压回收醋酸乙酯,浓缩至稠膏,干膏加适量水溶解,滤过, 滤液加至已预处理好的大孔吸附树脂柱(干膏和树脂的比例为1∶15)上,用水洗至洗脱液无色 ,换用60%乙醇洗至水杨酸检识为阴性,合并中间洗脱液,减压浓缩得流浸膏,低温真空干燥。2·2酸碱滴定法测定总有机酸含量2·2·1氢氧化钠溶液(0·1mol·L-1)的配制取适量氢氧化钠加水振摇使溶解成饱和溶液,冷却后,静置,澄清后备用。取澄清的氢氧化钠饱和溶液5·6mL,加新沸放冷的蒸馏水使成1 000 mL,摇匀。2·2·2供试品溶液的制备精密称取板蓝根提取物0·4 g,置50 mL锥形瓶中,无水乙醇溶解,即得。2·2·3样品含量测定供试品溶液中,加入酚酞指示液2滴,用标定好的氢氧化钠滴定液(0·074 9 mol·L-1)滴定,滴定至溶液显粉红色。每1 mL氢氧化钠滴定液相当于9·916 mg的水杨酸(C7H6O3),总有机酸以水杨酸计。2·3反相高效液色谱法测定板蓝根总有机酸中水杨酸的含量<7>2·3·1色谱条件Kromasil C18柱(4·6 mm×250mm,5μm);流动相乙腈-1%醋酸水溶液(25∶75),检测波长225 nm,流速1·0 mL·min-1,柱温为室温,理论塔板数按水杨酸计算不低于3 000。2·3·2对照品溶液的配制精密称定干燥的水杨酸对照品10·6 mg,100 mL量瓶甲醇定容,摇匀,0·45μm微孔滤膜过滤,即得对照品溶液。2·3·3供试品溶液的制备精密称取板蓝根提取物0·25 g,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取上述溶液1 mL,置100 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,用0·45μm微孔滤膜滤过,取续滤液即为供试品溶液。2 ·3·4线性关系的考察精密量取上述配制的对照品溶液0·25,1·0,2·0,3·0,5·0,6·0mL置10 mL量瓶中,无水乙醇稀释至刻度,摇匀,0·45μm微孔滤膜过滤,取上述溶液在选定的色谱条件下,分别进样10μL,以峰面积为纵坐标,含量为横坐标,绘制标准曲线。回归方程Y=2760X+105·0,r=0·999 8。结果水杨酸在0·027~0·63μg线性关系良好。2·3·5精密度试验对同一对照品溶液,重复进样5次,测定峰面积值,RSD 1·0%。2·3·6重复性试验取提取物粉末5份,适量,精密称定,按上述方法制备供试品溶液,测定计算含量,RSD 1·2%。2·3·7稳定性试验对照品和供试品溶液,按上述方法每隔2 h测定1次峰面积,结果水杨酸对照品溶液和供试品溶液在12 h内稳定。2·3·8加样回收率试验精密称取已知含量的样品5份,每份约0·12 g,分别精密加入水杨酸对照品溶液(0·13 mg·mL-1)2 mL,按“供试品溶液制备”项下操作,测定,计算回收率,结果见表1。表1水杨酸加样回收率称样量/g样品中含量/mg测得量/mg回收率/%平均值/%RSD/%0.121 6 0.267 5 0.532 2 101.80.119 5 0.262 9 0.531 8 103.40.119 8 0.263 6 0.529 3 102.2 101.9 1.10.124 6 0.274 1 0.538 7 101.80.122 5 0.269 5 0.530 6 100.42·3·9样品含量测定根据上述条件,分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μL, 注入液相色谱仪,按外标法以峰面积计算,对3批样品的含量数据如表2。表2板蓝根提取物中总有机酸及水杨酸含量%批次总有机酸水杨酸含量RSD含量RSD113.01 0.96 0.23 0.872 12.56 1.2 0.22 1.33 12.98 0.8 0.22 0.563讨论3·1试验所采用的酸碱滴定法是较常用的一种酸类物质含量测定方法,方法简单易 操作,但由于中药提取物颜色较深,会干扰滴定终点的确定,因而限制了它的应用。实验中样品经 D101大孔吸附树脂制备,提取物粉末颜色浅,避免了滴定时颜色的干扰,结果准确。3·2试 验采用大孔吸附树脂制备样品,上样液以澄清为好,以免堵塞树脂床,影响吸附效果。3·3有机 酸在水中很容易发生电离,产生多峰现象。为使有机酸尽可能以分子形式存在,一般使用酸性流动 相来抑制有机酸的离解。在流动相中加入醋酸,可使被测物保留时间适当,分离度良好,系统稳定 。板蓝根提取物中总有机酸和水杨酸含量测定方法研究@马莉$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039,成都中医药大学,四川成都610075
@唐健元$国家食品药品监督管理局药品审评中心!北京100038
@李祖伦$成都中医药大学!四川成都610075
@赵艳玲$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@廖庆文$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@肖小河$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@赵祥军$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@金城$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039目的:建立板蓝根提取物的质量控 制方法。方法:采用酸碱滴定法测定总有机酸含量,并用反相高效液相色谱法测定板蓝根提取物中 水杨酸的含量。结果:酸碱滴定法测得总有机酸含量为13.0%,RSD2.0%;HPLC测 得提取物中水杨酸的含量为0.22%,RSD1.6%。结论:该方法能有效控制板蓝根提取物 的质量。板蓝根;;提取物;;总有机酸;;水杨酸;;含量测定<1>高学敏.中药学.北京:人民卫生出版社,2000.485.
<2>中国药典.一部.2005.142.
<3>刘云海,秦国伟,方建国,等.板蓝根抗内毒素活性化学成分的筛选.医药导报,2002,21(2):74.
<4>Liu Y H,Qin G W,Ding S P,et al.Studies on chemical constituentsfrom root ofIsatis indigoticaI.Chin Tradi Herb Drugs,2001,32(12):1057.
<5>金薇,尤献民,张曦弘.电位滴定法测定复方板蓝根冲剂中总有机酸的含量研究.中医药学刊,2004,22(3):574.
<6>范国荣,胡晋红,李博华,等.四倍体板蓝根中五种有机酸成分的毛细管电泳分离分析.中国药科大学学报,2000,31(2):111.
<7>赵景婵,郭治安,常建华,等.有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件的研究.色 谱,2001,19(3):260.峋】赡芤苑肿有问酱嬖?一般使用酸性流动相来抑制有机酸 的离解。在流动相中加入醋酸,可使被测物保留时间适当,分离度良好,系统稳定。板蓝根提取物 中总有机酸和水杨酸含量测定方法研究@马莉$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039,成都中医药大学,四川成都610075
@唐健元$国家食品药品监督管理局药品审评中心!北京100038
@李祖伦$成都中医药大学!四川成都610075
@赵艳玲$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@廖庆文$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@肖小河$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@赵祥军$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039
@金城$解放军302医院解放军中药研究所!北京100039目的:建立板蓝根提取物的质量控 制方法。方法:采用酸碱滴定法测定总有机酸含量,并用反相高效液相色谱法测定板蓝根提取物中 水杨酸的含量。结果:酸碱滴定法测得总有机酸含量为13.0%,RSD2.0%;HPLC测 得提取物中水杨酸的含量为0.22%,RSD1.6%。结论:该方法能有效控制板蓝根提取物 的质量。板蓝根;;提取物;;总有机酸;;水杨酸;;含量测定<1>高学敏.中药学.北京:人民卫生出版社,2000.485.
<2>中国药典.一部.2005.14
More abstracts about the 板蓝根提取物中总有机酸和水杨酸含量测定方法研究