中药肝炎平是同济肝病研究所李绍白教授在多年临床实践中总结的一个抗肝纤维化方剂。通过近几年 的临床观察,证明其具有良好的抗肝纤维化作用,能降低患者的肝纤维化指标。动物实验亦表明其 具有抗肝纤维化作用<1,2>,但机制尚不明确。本实验采用HPLC-ECD法检测CCl4 致肝纤维化大鼠模型肝组织交感神经递质NE和DA的表达,探讨交感神经递质在肝纤维化中的作 用及肝炎平在抗肝纤维化中的可能机制。1材料与方法1·1实验材料1·1·1实验动物40只 Wistar成年大鼠,雌雄各半,体重180~220g,由本校实验动物中心提供。1·1· 2试剂与药物CCl4由汕头光华化学厂生产,批号20010915,用前配成40%的橄榄油 溶液;橄榄油由北京芳草医药化工研制公司生产,批号288428。离子对试剂辛烷磺酸钠(O SA)购于美国Tedia公司。NE和DA标准品及内标DHBA(3,4-dihydrox ybenzylamine)购于Sigma公司。肝炎平由同济医院肝病研究所提供,批号02 1010。由黄芪、丹参、虎杖、苦参等药物组成,由同济医院中药房制成片剂,实验前研成粉末 后配成0·29g/ml的溶液。1·1·3主要仪器美国Varian高效液相色谱仪,Pro star370电化学检测器,检测器工作电极为玻碳电极,参比电极为Ag/AgCl电极。色谱柱采用德国KnauerC18反相柱(5μm,250mm×4·6mmID)。1·2实验方法1·2·1动物分组及处 理实验动物随机分为:正常对照组(N组),
模型组(M组,CCl411周)和肝炎平组(G组 )。除N组正常饲养外,其余两组开始两周给予高脂饲料(79·5%基本饲料+10%玉米油+ 10%猪油+0·5%胆固醇),以后基本饲料喂养,按体重计量首次给予纯CCl40·5ml /100g皮下注射,此后按0·3ml/100g皮下注射40%CCl4橄榄油溶液,2次/ 周,共6周,随机抽杀两只M组大鼠确定造模成功。之后改为1次/周,直到实验结束。第7周开 始G组大鼠按1ml/100g给予0·29g/ml的肝炎平悬液灌胃,1次/d;N及M组灌 等量的生理盐水,直到实验结束。上述动物在实验结束时迅速剪下肝组织,冰上剪成小块立即-8 0℃冻存。1·2·2肝脏病理学检测取同一部位的肝组织用10%甲醛溶液固定,常规脱水,石 蜡包埋、切片,进行常规HE染色。1·2·3标准品和内标配制由于生物体的体液和组织中不存 在DHBA,且其在电流检测器中与NE和DA反应相同,故选用DHBA作为内标。NE、DA 和DHBA均以流动相稀释,前两者配成800ng/ml的储备液,内标配成0·1mmol/ L,均置于-20℃保存。用之前稀释到所需浓度。1·2·4样品准备称取肝组织50~60m g,加0·4ml流动相和0·1ml,0·01mmol/L内标混匀,充分匀浆后超声裂解约 1分钟。13000rpm,4℃离心20分钟。取上清进样,进样量为50μl。1·2·5标 准曲线绘制为检测肝组织中的NE和DA,制备标准曲线:NE和DA含量均为2·5、5·0、 10·0、20·0、40·0ng/ml,以内标和NE及DA量的相对值获得峰面积比绘制标准曲线。1·2·6HPLC-ECD条件分析柱为KnauerEurospherr-100C18反相柱(250×4·6mmID)。去离子水配制流动相:50mM磷酸,50mM柠檬酸,100mg/L OSA,20mg/L EDTA,2mmol/L KCl,用KOH调pH值至3·1;再以0·22μm孔径的滤膜过滤;最后加5%色谱级甲醇( V/V);流速1·0ml/min。电化学检测器工作电压:+0·65V;柱温:30℃;此 条件下NE、DA和DHBA分离良好。1·3统计学方法各组测定结果均以均数±标准差(x- ±s)表示,所有数据用SPSS11·5进行分析,组间均数差异的显著性采用Student -Newman-Keuls检验。2结果2·1HE染色模型组(见插页图1):正常的肝小叶 结构被破坏,汇管区和肝小叶内坏死区可见大量纤维组织增生,形成较宽阔但厚薄不均且互不连接 的纤维间隔,出现明显的肝纤维化;肝细胞发生气球样变、嗜酸性变及严重的脂肪变性;且坏死较 重,表现为灶状、片状坏死伴较多的炎性细胞浸润。肝炎平组(见插页图2):肝细胞脂肪变性明 显减轻,仅有少量小脂滴存在;肝细胞的坏死极轻,少数点状坏死伴少许炎性细胞浸润。纤维结缔 组织明显减少,仅见细薄的纤维束,无明显的假小叶形成。2·2肝组织内NE和DA的分离图谱 见图3~6。图3正常参照组大鼠肝组织提取物的分离图谱图4加入DHBA和标准品的正常肝组 织提取物分离图谱图5肝炎平组大鼠肝组织提取物分离图谱图6模型组大鼠肝组织提取物分离图谱 2·3肝炎平对CCl4肝纤维化大鼠肝组织内NE和DA的影响肝炎平组和模型组大鼠肝组织内 NE含量降低,与正常对照组相比,差异有显著性意义(P<0·01),模型组肝组织内NE含 量低于肝炎平组(P<0·05);而DA在3组中的含量差异无显著性意义(P>0·05),见表1。表1肝组织内NE和DA水平(x-±s,ng/g)组别nNE DAN组8258±47123±59M组1589±24*106±41G组15129±37* △93±25与N组比较,*P<0·01;与M组比较,△P<0·053讨论人体各器官的功能都直接或间接处于神经系统的调节控制之下,肝脏也不例外。Trim等<3>研究发现,活化的肝星状细胞(HSC)表达P75(肿瘤坏死因子受体超家族的一个成 员),而静止的HSC不表达P75;认为其可作为标志HSC活化的一个良好指标,并推测HSC可能来源于神经嵴。说明肝脏与神经系统有着密不可分的联系。DubuissonL等<4>以CCl4诱导的肝纤维化大鼠为模型,通过破坏肾上腺素能神经纤维或通过α受体阻断 肾上腺素能神经传导通路,抑制了肝纤维化的发展,提示神经系统在肝纤维化的发生与发展过程中 发挥重要作用。中药肝炎平已用于临床治疗多年,通过近几年的临床观察,证明其具有良好的抗肝 纤维化作用,能降低患者的肝纤维化指标,但其机制有待明确。唐望先等<5>发现肝炎平能降低 血吸虫肝纤维化兔血清中的各项肝纤维化指标,有抗肝纤维化的作用;在CCl4诱导的大鼠肝损 伤模型中,肝炎平能减轻肝细胞损伤,抑制胶原增生,有预防肝纤维化的作用<2>,但对其作用 机制的主要环节尚未完全清楚。本实验病理结果表明肝炎平可显著改善CCl4造成的大鼠肝纤维 化损伤,减少肝脏胶原纤维的产生,改善组织病理学变化,肝内炎性活动减轻,纤维化程度减轻; HPLC-ECD法测定肝组织内NE和DA含量,显示模型组大鼠肝组织内NE的含量最低,肝 炎平组NE含量增加,但仍较正常组低,而DA含量在3组中无明显改变;提示肝炎平抗肝纤维化 的机制可能通过调节肝纤维化大鼠肝内的NE含量起作用。这与阎玉矿等的研究一致。阎玉矿等< 6>应用改良乙醛酸法诱发儿茶酚胺荧光显示肝内肾上腺素能神经,发现CCl4大鼠肝硬变门脉 高压模型大鼠肝内存在NE能神经,但在病变区减少或缺乏;汇管区增生结缔组织内常可见荧光较强的交感神经纤维网。而国外许多研究表明NE能活化HSC,促进肝纤维化的发生发展。SchwetzBA等<7>同时用NE和CCl4对小鼠进行皮下注射,发现其可促进CCl4诱导的肝毒性作用,使血清中GPT水平升高。Oben JA等<8~10>研究发现:HSC能够表达肾上腺素能受体及多种儿茶酚胺生物合成酶、释放N E;α及β肾上腺素受体拮抗剂能抑制其生长。但这些研究是通过观察培养的HSC或以外源性N E干预实验进行实验,并未检测肝组织内的内源性NE和DA含量变化。究竟在肝纤维化的发生发 展中内源性NE含量是如何变化及其如何发挥作用的,尚有待进一步研究。肝炎平对肝纤维化肝组 织中去甲肾上腺素和多巴胺的影响@张芳杰$华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所!湖北武汉430030
@晏维$华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所!湖北武汉430030
@高啸$华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所!湖北武汉430030
@郭燕$华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所!湖北武汉430030
@但自力$华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所!湖北武汉430030
@赵秋$华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所!湖北武汉430030
@唐望先$华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所!湖北武汉430030目的:探讨肝炎平 在四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型中对肝脏中去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA) 的影响及其抗肝纤维化的可能机制。方法:CCl4诱导大鼠慢性肝纤维化模型。随机分为正常组 、肝纤维化模型组和肝炎平治疗组。用高效液相色谱-电化学(HPLC-ECD)法检测肝组织 中NE和DA水平。结果:肝炎平组和模型组大鼠肝组织内NE含量明显低于正常组(P<0·0 1),且模型组NE含量低于肝炎平组(P<0·05);而DA在3组中的含量差异无显著性意 义(P>0·05)。结论:肝炎平可增加肝纤维化肝组织中NE的含量,可能主要通过调节肝纤 维化大鼠肝脏中的NE含量而达到抗肝纤维化的作用。肝炎平/
药效学;;
肝纤维化;;去甲肾上腺素;;
多巴胺;;高效液相色谱-电化学;;
大鼠1TangWX,Zi-Li Dan,Hong-Mei Yan,et al.Experi mental study of effect of Ganyanping on fibrosisin rat liver.World Joural of Gastroen-terology,2003,9(6):1292~1295
2唐望先,虞涤霞,但自力,等·肝
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