苯妥英(phenytoin)是抗癫痛大发作的首选药物， 此外，还常用于抗心律失常、抗三叉神经痛等。1985 年，临床应用发现川，低剂量苯妥英钠(50一100 mg) 具有平喘、镇咳、祛痰作用，可用于治疗慢性喘息型支 气管炎，特别是老年性慢性支气管哮喘。 目前测定苯妥英血药浓度的方法多针对治疗癫 痈时的血药浓度监测，主要有HPLc一uv<’川，荧光偏 振免疫法囚、酶吸附免疫法〔5〕及毛细管区带电泳法 等<‘」。这些方法对检测灵敏度要求不高，其定量下限 均>l卜g·mL一‘。市售复方妥英麻黄茶碱片的剂量 为每片含苯妥英钠50 mg，因此，需建立一种专属、灵 敏、快速的液相色谱一串联质谱法，测定健康受试者 单剂量服用苯妥英钠50 mg后的血浆浓度，并用于复 方制剂中苯妥英的生物等效性评价。 材料、对象与方法 1药品、试剂与仪器 受试制剂:复方妥英麻黄茶碱片，规格:每片含苯 妥英钠50 mg、咖啡因7.5 mg、茶碱12.5 mg、可可碱 12.5 mg、盐酸麻黄碱5 mg和马来酸氯苯那敏1 mg， 批号:030801，山西三九同达药业有限公司研制;参比 制剂:复方妥英麻黄茶碱片，规格同前，批号: 20040004，大同星火药业有限责任公司生产;标准品: 苯妥英钠，含量98.2%，由山西三九同达药业有限公 司提供;内标:柳胺酚(osalm记)，含量99 .5%，由沈阳 药科大学药物合成教研室提供。甲醇为色谱纯，其他 试剂均为分析纯;空白血浆，由沈阳中心血站提供。 TsQ Quantum ultra型三重四极杆串联质谱仪，配 备大气压化学电离源(APCI源)及xcalibur 1 .4数据 处理系统，美国Thermo Finnigan公司产品;LC- 10ADvP输液泵和SIL一HTh型自动进样器，日本岛津 公司产品;Turb0Vap蒸发仪，美国zymark公司产品。 2受试者选择 选择健康男性受试者20名，年龄为20一27岁，身 高165一184 em，体质量指数(BMI)均在正常值19- 24 kg·m一’内。受试者无既往病史和药物过敏史，试 验前14天内，未用任何药物。接受全面的体格检查， 对肝、肾功能进行化验测定，并进行心电图检查，结果 均属正常。签署知情同意书。 3给药方法及血样采集 用随机双交叉试验设计。 将20名受试者随机分成2组，每组10人。第1 次，第1组口服受试制剂1片;第2组口服参比制剂l 片;第2次，第1组口服参比制剂1片;第2组口服受 试制剂1片。2次试验间隔为1星期。受试者于试验 前l日晚8:oo，开始禁食;试验当日晨，空腹服药，用 温开水240 mL送服。服药后4h和10h，进食统一标 准餐。 于服药前(oh)和服药后0.33，0.67，1.0，1.5， 2 .0，3 .0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0，72.Oh 由前臂静脉取血4 mL，立即移人经肝素处理的离心试 管中，3 500:·min一‘离心10 min，分离血浆;于一Zooe 冰箱中冷冻保存，待测。 4测定方法 4.1色谱条件 Zothax SB一CI:柱(15omm x 4.6 mm，5林m;美国 安捷伦公司);流动相为甲醇一水一甲酸(90:10: 0.2);流量为0.6 mL·min一’，进样量20林L;柱温为室 温。 4.2质谱条件 离子源为大气压化学电离源(APCI)，电晕放电电 流为4.0林A;加热毛细管温度为320℃，气化室温度 为420℃，鞘气(N:)压力0.64 MPa，辅助气(N:)流量 为3L·min一’，正离子方式检测;扫描方式为选择反 应监测(SRM);碰撞气(Ar)压力0.19Pa。苯妥英和 柳胺酚的碰撞诱导解离(CID)电压分别为20，25 eV; 用于定量分析的离子反应分别为爪八253、m八182 (苯妥英)和m/z 230、m/:l2l(内标柳胺酚);扫描时 间为o·350 4.3标准储备液配制 精密称取苯妥英钠标准品ro.9 mg(相当于苯妥 英10.0 mg)，置于25 mL溶量瓶中，用甲醇溶解并稀 释至刻度，摇匀，配成浓度为400此·mL一’的苯妥英 储备液;精密称取柳胺酚标准品10.0 mg，同法配制浓 度为400林g·mL一’的柳胺酚(内标)储备液。以甲醇 一水(50:50)稀释苯妥英储备液，得浓度依次为 30(X)，1 500，5(X)，200，60.0，20.0，8.0和2.sng· mL一’的标准系列溶液;同法配制浓度为2.5，60.0和 2 400 ng·mL一’的质控(Qc)样品;以水稀释柳胺酚储 备液配成浓度为800 ng·mL一‘的内标溶液。 4.4血浆样品处理 取血浆50林L，置于10 mL带塞试管中，依次加人 甲醇一水(50:50)溶液50林L，内标溶液(800 ng· mL一’柳胺酚水溶液)50林L，0.5 mol·协L一’磷酸溶液 100林L，混匀;加乙醚一异丙醇(25:1)3 mL，涡流混合 1 min，往复振荡15 min，3 soor·min一‘离心5 min;分 取上层有机相于另一试管中，40℃空气流下吹干，残 留物于流动相巧o林L中溶解;涡流混合，取20林L进 行LC/MS/MS分析。 5方法学考察与评价 5.1质谱分析 用正离子方式检测，在一级全扫描质谱图中，得 苯妥英和内标柳胺酚的准分子离子峰，分别为爪众 253和从众230;选择性对准分子离子峰〔M+H〕+进 行二级质谱分析，苯妥英及内标生成的主要碎片离子 分别为m/:182和m/:121，用于SRM扫描时监测产 物离子。其主要碎片离子和质谱断裂方式如图1所 示。 5.2专属性 取空白血浆50林L，按“血浆样品处理”项下操作 (不加内标溶液)，进样20林L，得色谱图ZA;将一定浓 度的苯妥英对照溶液和内标溶液加人空白血浆中，依 同法操作，得色谱图ZB，苯妥英和内标的保留时间均 为2.7 min;取受试者口服给药后的血浆样品，依同法 操作，得色谱图ZC。由图2可见，空白血浆中的内源 性物质也不干扰苯妥英和内标的测定。另外，同服用 的药物茶碱、可可碱、咖啡因、氯苯那敏和麻黄碱等在 182刀9 0奋”.___ 沂’“ 脚军华悠黔 501叻 l仍.脸133.05 】7409 ，知，‘ ml之 嘿 22，付乃又30卫翻劫 毗”1卜门 曳尸、。;‘ 服 粼翻半 200 250 3080 3684 4386 4827 .产甲，，，尸尸甲，.尸门，尸尸，，，~尸，.户甲，， 3的350月00 4505加 RgUre 1 .Pn〕duetion mass一spee比of
+of phenytoin(A) and osal而d(B) APCI正离子方式下获得的准分子离子和碎片离子峰 与待测物及内标均不同，因此不干扰测定。 m乞253砷m众182 NL:200 E3 狱~尸际妙人碱呱办卿 瓜艺253，瓜乞182 NL:104E4 栩龙253刁勿洲七182 刊L:3 .63 E4 m/z 230*m/z 121 NL:1 .00 E4 m了乞230冲m龙121 NL:3 .92 E6 皿活230，m念121 NL:1 .32E6 Fi四re 2.Typieal ehromatogranls Ofphenytoinando刘mid(internalstandard，15)inhu manplasmabyselected花actionmonitoring(SRM)seanlllede^.Bla吐pla，ma;B.B认nk plasma spiked with60ng·mL一Iphen脚inandsoong·mL一115;C.Plasmasamplel.sh血ranoraldoseofsomgpheny- toin sodium to a healrh volunteer:Channelm/z 253叶182，phe刀ytoin;Channel用态230一121，IS，05司mid 5.3标准曲线方程制备和定t下限 取空白血浆50卜L，加苯妥英标准系列溶液50 林L，配制成相当于苯妥英血浆浓度为2.5，8.0，20.0， 60.0，200，500，巧oo和3000 ng·mL一‘的血浆样品，按 “血浆样品处理”项下依法操作，进样20林L，建立标准 曲线。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰 面积比值为纵坐标，用加权(w=l/口)最小二乘法进 行回归运算叫，求得的直线回归方程即为标准曲线。 典型回归方程为:，=4.63 X 10一4+3.75/10一，x (7二0.9978);苯妥英的线性范围为2.5一3以X〕.0 ng·mL一’;定量下限可达到2.5 ng·mL一’。 5.4精密度与准确度 取空白血浆50林L，按“标准曲线和定量下限”项 下方法配制低、中、高3个浓度(2 .5，60.0和2 400.0 ng·mL一’)的质量控制(QC)样品，每一浓度进行6样 本分析，连测3天，根据当日的标准曲线，计算QC样 品的浓度，将Qc样品的结果进行方差分析〔‘〕，求算本 法的准确度与精密度，结果见表1。在3个浓度下，苯 妥英日内精密度RSD<7 .0%;日间精密度RSD< 6.8%;准确度RE在土2.3%内。 一日卜丁est 一闷卜-Re佃.即ee 0 CUfl O八U门 乙n月q、一 乙‘因u七。一裕﹂七︸。。uo口 下曲Ie 1 .Preeision and acCuraey for the LC/MS/MS analysis of Phenytoin(n二18) 12 24 36 48 60 72 t/h Coneentnlti
More abstracts about the 液相色谱-串联质谱法测定苯妥英在健康人体的血药浓度并研究其生物等效性