众所周知心跳骤停的发生率很高,据统计北京市男性的年平均发病率高达10.5/10万<1>,但目前心肺复苏(card iopulmonary resuscitation,CPR)的成功率很低,能迅速恢复自主循环的仅有14%~30% 。而复苏后存活的病人中,出院率由于脑复苏的失败而更低,原因主要是由于缺血再灌注损伤导致 继发性脑损害。因此在心肺复苏中脑缺血与再灌注损伤的防治就显得尤其重要。本研究是通过观察 在心肺复苏犬模型上使用纳洛酮后脑组织S100蛋白、S100B蛋白mRNA表达及组织病理 学的变化,了解纳洛酮在CPR中所起的作用,为临床CPR过程中使用纳洛酮提供实验依据。1 资料与方法1.1对象及分组健康成年杂种犬18只,由广州白云区新市石马实验动物场提供。体质量10~15kg,雄性5只,雌性13只,随机分成3组,每组6只。空白组:不诱发室颤。对照组:心跳骤停 后按标准心肺复苏术处理。纳洛酮组:心跳骤停后按标准心肺复苏术并给予纳洛酮治疗。1.2方法氯胺酮10mg/kg诱导麻醉后,以氯胺酮10~15mg/kg静脉滴注维持麻醉。气管切开,同时行心电监护,经股动脉测量动脉压力。采用交流电体外电击诱发室颤(电压为3.5~4.5 V/kg,通电5 s)的方法,维持室颤3 m in,室颤3 m in后开始心肺复苏。对照组:心跳骤停后按标准行心肺复苏术,予电击除颤160 J,如无效再行1次,连接呼吸机(R 25~30次/m in,Vt 20 mL/kg,FiO2100%),胸外按压120次/m in直至出现自主循环,且在复苏过程中使用肾上腺素、阿托品、多巴胺等药物。纳洛酮组:心跳骤停后按标准行心肺复苏术+纳洛酮(0.06 mg/kg,开始复苏时使用,每隔30 m in静脉推注1次,至实验结束为止)。以恢复自主心律及平均动脉血压>80 mmHg为复苏成功标志。对照组和纳洛酮(NLX)组均在5 m in内复苏成功,两组对照无统计学意义(P>0·05)。各组使用复苏药物种类、剂量无差别。1.3组织学检查在复苏后6 h开颅取脑组织,脑采用10%甲醛固定,石蜡包埋,切片后苏木精-伊红染色,光镜下观察海马CA1区组织病理学变化并用显微微尺测量该区锥体细胞密度。1.4 S100B蛋白mRNA表达的检测开颅取右脑海马组织(同一部位)约100 mg,置于液氮中迅速冷却后置于-70℃冰箱保存,备提RNA用。通过逆转录聚合酶链法(RT -PCR)进行S100B蛋白mRNA表达的检测。采用Trizol法提取总RNA,所提的 RNA的OD值在1.8~2.0之间,Trizol购自Invitrogen公司,RT-P CR试剂盒购自Promega公司。引物由上海申友生物技术有限公司合成,PAGE法纯化。引物序列:S100B<2>:上游:5-AGCTGT GGA GCC GCT GAC GAT GTC-3;下游:5-GCC CTG ACC ACG GCG GAG CAC A-3;-βactin:上游:5-ATC ACC ATT GGC AAC GAG CG-3;下游:5-GAC CTT CCC AAC CCT GTT AGA-3。产物长度分别为:494 bp,692 bp。变性、退火、延伸条件分别为94℃30 s、59℃1 m in、68℃2 m in,共30个循环。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,结果在凝胶成像系统(UVITEC DBT-08)中分析,目的基因表达水平以目的基因凝胶电泳条带与内参照基因-βactin的 灰度值之比(半定量分析)来评价。1.5免疫组化采用S-P法。S100多克隆抗体、二抗均 购自DAKO公司;抗原修复液、DAB发色液均由福建迈新生物技术有限公司提供。取病理切片(片厚5μm)后脱蜡至水,在60℃恒温箱中烘烤30m in。抗原修复后,经过过氧化氢甲醇溶液处理,加入S100多克隆抗体,每片200μL(工作浓度1∶400),37℃孵育60 m in,加入二抗37℃孵育30 m in,DAB显色,脱水透明后封片。PBS代替-抗作为阴性对照。镜检观察计数:在海马CA1 区随机选择4个视野(400×)进行S100阳性细胞计数。1.6统计学处理应用SPSS1 0.0统计软件包进行统计学分析。实验数据以平均数±标准差(x-±s)表示,采用方差分析 检验,取P<0.05为差异显著,P<0.01为差异非常显著;相关分析采用皮尔逊相关分析 。2结果与分析2.1脑海马组织常规病理观察经HE染色后在光镜下观察脑海马组织(见图1~ 3),对照组病理变化明显,可见神经元脱失、神经元胞浆浓缩、胞核固缩、核仁不清、周围出现 异常扩大的腔隙、毛细血管明显肿胀变形,微血管体积扩大以致原来不易在镜下识别变得能识别。 而纳洛酮组相同部位的神经元脱失和损伤轻于对照组:大部分神经细胞胞浆丰富,核呈圆形,核仁 清楚,仅少数神经细胞和毛细血管出现程度不等的水肿样改变及胞核固缩现象。图1空白组中的正常神经元(箭示:胞浆丰富,细胞核边界以及核仁清楚)Fig.1 N orm a l neu ron in b lank group(arrow w ith abun-dan t cy top lasm,w e ll-d em arca ted nu c leu s and nu-c leo lu s)图2对照组中的受损神经元(箭示:胞浆浓缩、周围出现异常扩大的腔隙、核仁不清)F ig.2 D am aged neu ron in con tro l group(arrow:show ingconcen tra tive cy top lasm,per ineu rona l space andd isrup ted nu c leo lu s)图3纳洛酮组受损神经元较少(H E,400×)F ig.3 T he dam aged neu ron s w ere rare in na loxone group(H E,400×)图4空白组海马CA 1区(H E,50×)(图中神经元形态数量均正常,镜下无微血管显示)F ig.4 H ippocam pu s CA 1 area of b lank group(H E,50×)(The number and shape of neuron were norm al and nocap illaries were shown underm icroscope.)图5对照组海马CA 1区(H E,50×)(图中见神经元数量减少,受损神经元(箭头)、肿胀变形的微血管比空白组、纳洛酮组明显增多)F ig.5 H ippocam pus CA1 area of con tro l group(HE,50×)(The number of neuron decreased,the dam aged neuron(arrow)and edem atous or d istorted m icrovessels increased sign ificantlycompared w ith b lank group and NLX group)图6纳洛酮组海马CA 1区(H E,50×)(图中见神经元数量较对照组多,较空白组少,受损神经元(箭示)较对照组少)F ig.6 H ippocam pu s CA 1 area of NLX group(H E,50×)(The number of neurons was more than that of control group,but less than b lank group.The dam aged neuron(arrow)de-creased compared w ith the control group.)图7 S100阳性细胞(免疫组化染色,S-P法,400×)(图中箭头所指为一S100阳性星形胶质细胞,细胞的胞核及胞浆均被染色)F ig.7 S100-positive ce ll(imm unoh istochem ica l sta in ing,S-P m ethod,400×)(The cytop lasm and nuc leus of S100-positive cells(arrow)wereboth stained)图8空白组海马CA 1区(免疫组化染色,S-P法,100×)(图中S100阳性细胞少见)F ig.8 H ippocam pu s CA 1 area of b lank group(im-m uno-h istochem ica l sta in ing,S-P m ethod,400×)(S100-positive cell was rare in F ig.8)图9对照组海马CA 1区(免疫组化染色,S-P法,100×)(S100阳性细胞较多,与空白组、纳洛酮组比较均增多)F ig.9 H ippocam pu s CA 1 area of con tro l group(im-m uno-h istochem ica l sta in ing,S-P m ethod,400×)(S100-positive cells(arrow)increased in control group com-pared w ith b lank group and NLX group)图10纳洛酮组海马CA 1区(免疫组化染色,S-P法,100×)(S100阳性细胞较空白组多,较对照组少)F ig.10 H ippocam pu s CA 1 area of con tro l group(im-m u-noh istochem
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