半胱天冬酶(caspase)是一个半胱氨酸蛋白酶家族,在细胞凋亡的过程中起着关键性的作用 ,是药物开发的良好靶点。目前,该家族已有14个成员被克隆出<1>,在氨基酸序列、结构及 酶的特性上均相似,根据在级联反应上下游的位置及功能的不同,可分为3大类。第1类为上游的 凋亡始动子,包括cas-pase-2,-8,-9,-10等,能在其他蛋白参与下发生自我 活化并激活下游的caspase;第2类为下游的凋亡效应子,包括caspase-3,-6 ,-7,被始动子激活后作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变,导致细胞凋亡;第3类 包括caspase-1,-4,-5,-13,-14,主要参与细胞因子介导的炎症反应并在 死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。由于caspase可自我活化并能相互激活,因此 凋亡过程一旦触发,即呈级联放大效应。caspase介导细胞凋亡的途径及作用底物均很多, 以致其介导的细胞凋亡机制错综复杂,因此,人们对探索研发以caspase为靶点的药物的方 法和策略也不少。本文将对近年来人们在以调节cas-pase活性为治疗靶点方面所做的研究 进行综述。1caspase抑制剂许多疾病和一些严重损伤因素的病理过程与组织细胞的过度凋 亡有关,caspase抑制剂通过抑制caspase活性达到抑制细胞凋亡、改善疾病状态的 目的。caspase抑制剂有天然的和人工合成的,目前,研究和开发的重点是人工合成的caspase。1.1天然的caspase抑制剂<2>细胞因子效应调节剂A(cytokineresponse modifi-er A,CrmA)是第一个被证实的天然caspase抑制剂,结构上属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease in-hibitor)家族,能抑制caspase-1和-8的活性。Goswami等研究发 现,用CrmA转染PC12细胞能够有效抑制caspase-8的活性,阻断肿瘤坏死因子α (TNF-α)诱导的细胞凋亡。CrmA还能抑制由于缺氧所引起的心肌细胞中caspase -8的激活,以及相应的线粒体跨膜电位的下降和凋亡发生等。另一类常见的是凋亡蛋白抑制剂(inhibitorsof apoptosis protein,IAP),在人体中研究最多的是生存蛋白(survivin)和活素蛋白,能 与caspase-3和-7直接结合并抑制其活性,后者还能抑制caspase-9的活性。 survivin和活素蛋白在正常细胞中不表达或低表达,但是,在胚胎及肿瘤细胞中则异常表 达,提示抑制其表达将有可能成为肿瘤治疗的新策略<3>。其他天然的caspase抑制剂如 p53蛋白能抑制caspase-1,-3,-6,-7,-8和-10的活性,其机制与p5 3蛋白的P1位点被caspase水解后导致亚单位与caspase形成稳定的复合体有关。 细胞内Zn2+浓度降低会激活caspase-3,-8和-9,从而导致凋亡发生,其作用机 制主要是干扰Fas配体路径及抑制caspase-3活性。Gunasekera等发现从深 海的Batzella属海绵中分离得到的一系列的天然小分子化合物能抑制caspase-3 的活性。另外,Zech等<4>研究发现,一氧化氮(NO)供体能抑制凋亡促进因子-1(A paf-1)/caspase-9凋亡复合体的形成,从而抑制pro-caspase-3, -8和-9的加工处理而起到抑制凋亡的作用。1.2人工合成的caspase抑制剂1.2. 1短肽衍生物抑制剂根据caspase底物的识别部位而获得的一些特异性caspase短肽 衍生物抑制剂,作为活性caspase的假性底物竞争性抑制cas-pase活性,但并没有 改变caspase蛋白酶的化学结构。短肽衍生物抑制剂的大小从单一的天冬氨酸(Asp)残 基(Boc-Asp-FMK)到三聚体(z-VAD-FMK)和四聚体(YVAD-FMK) 不等,但最近由Maxim制药公司推出的MX1013是二肽模拟物<5>。短肽所连接的化学 基团决定了其抑制机制是否可逆,一般而言,连接氟-甲基酮(-FMK)或氯-甲基酮(-CM K)可得到不可逆的竞争性抑制剂;与醛基(-CHO)、腈类(-CN)基团连接则得到可逆性 抑制剂。同时,这些化学基团也决定了短肽衍生物抑制剂的细胞膜渗透性,对于完整细胞,连接- FMK基团的抑制剂膜渗透性较好,而连接-CHO基团的抑制剂则很难进入细胞。虽然合成的短 肽抑制剂对caspase特异性较高,但z-VAD-FMK、z-DEVD-FMK和AC- YVAD-CMK也会对少数其他蛋白酶起抑制作用,而且多数并不只针对单个cas-pase 发挥作用,如z-VAD-CHO能有效抑制caspase-1,-3,-5,-8和-9活性 。随着研究的发展,一些特异性更高的也陆续研制出来,如YVAD-CHO抑制caspase -3最有效,z-IETD-FMK选择性抑制caspase-8,而z-LEHD-FMK仅 抑制caspase-9活性。caspase抑制剂的细胞保护作用在许多与过度细胞凋亡相关 的疾病动物模型上得到广泛证明。例如,Chandrashekhar等<6~9>研究发现, 给心肌梗死后发生急性肺损伤、肾毒性肾炎、蛛网膜下腔出血和心力衰竭的动物注射胰-半胱天冬 酶(pan-caspase)抑制剂可显著降低细胞凋亡水平。新的抑制剂IDN-1965和 IDN-6556(IDUN制药公司)可能会减少一些如心脏和肝脏损伤病理状态下的细胞损害 量<9,10>。值得一提的是,在上述疾病模型上,动物发生炎症减少、生存期延长等情况也是 很明显的。这是因为目前所开发的大多数cas-pase抑制剂都是广谱抑制剂,因此,既可以 抑制凋亡,又可以影响炎症过程,如caspase抑制剂在败血症大鼠模型上就表现出高度保护 作用。近期出现的广谱caspase抑制剂MX1013(Maxim制药公司)在Fas介导 的肝损害、脑缺血或再灌注损伤、急性心肌梗死动物模型上也表现出类似的高保护效果<5>。因 此,这些广谱caspase抑制剂的临床前试验提示这些药物有潜力成为抗凋亡的新药。事实上 ,由IDUN制药公司研制的广谱caspase抑制剂IDN-6556首次应用于人体,用于口服治疗慢性丙型肝炎病毒(HCV),现正在进行Ⅱ期临床试验;而且在凋亡研究中发现,IDN-6556对肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelial cell,SEC)的凋亡抑制率及caspase-3活性的抑制率分别达到了55%和94%< 9>。而Vertex制药公司在推出cas-pase-1抑制剂的口服液VX-740和VX -765后,又成功研制出治疗败血症疗效更佳的药物VX-799。1.2.2合成的小分子化 合物氯乙亚硝脲(BCNU)是一种双功能烷化剂,能抑制依托泊甙诱导的HT58凋亡细胞中的 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)裂解活性,与抑制caspase-3活性有关。双硫仑 (disulfiram)是解酒药,最近发现也是caspase-3抑制剂。其他如异硫脲类化合物,peptidylbeta-homo-as-partals(3-amino-4-carboxybutyra ldehydes)和3-亚硝基苯甲酰胺等对caspase的若干亚型也具有抑制作用。这些 小分子化合物结构简单,易于购得和合成,可以作为研究设计小分子caspase抑制剂的基础 。1.3其他近年来,人们提出利用分子生物学技术研究和开发新一代核酶类抗caspase蛋 白酶抑制剂,筛选出高活力、高特异、高稳定的抗caspase核酶,通过其抗细胞凋亡的特性 ,来调控体内组织的炎症,从而阻断细胞的坏死,达到改善疾病状态的目的。Zender等<1 1>研究表明,小干扰RNA(siRNA)介导的肝cas-pase-8基因表达抑制可保护 体内外的Fas介导的细胞凋亡。张韦等通过体外实验发现,其构建的核酶Rz333能够位点特 异性地切割caspase-7mRNA。Xu等在BRL-3A细胞也发现其构建的核酶Rz1 07对caspase-3具有特异性的切割作用,并提出将核酶治疗作为凋亡所致肝脏疾病的一 种治疗手段是可行的。但将siRNA等核酶类caspase抑制剂作为一种治疗工具仍需要进 一步的研究。2caspase激活剂选择性激活caspase或至少降低其激活阈值,可能有 助于治疗发病机制与凋亡缺陷有关联的癌症及其他一些疾病。目前,针对caspase激活和引 发凋亡进程的不同方案仍处于临床前试验阶段。Sophie等发现,一种名为安全扣(safe ty-catch)的门冬氨酸三联体分子可促发分子内静电作用而使caspase-3处于非 激活状态,推断若阻断该分子将有可能激活cas-pase-3而触发凋亡。因此,人们尝试着 针对该三联体分子的空间结构,设计一些具有药理学活性的小分子药物(绝大多数是多肽)来降低 caspase-3的激活阈值或使其直接被激活,希望能因此杀伤癌细胞或至少能逆转耐药癌细 胞的抗药性。如Maxim制药公司已经研制出的caspase-3激活剂MX-2060等一 系列多肽类药物,经临床前试验已被证实具有抗癌活性,且作用机制不同于传统的抗癌药物。另一 条触发凋亡的途径是以和凋亡效应子caspase连结的抗体融合蛋白或化合物为工具。Jia 等<12>研制出一种被称为免疫半胱天冬酶(immunocaspase)-3或-6的嵌合 蛋白,是由一单链抗erbB2/HER2抗体和一激活的caspase-3或-6分子组成的 。结果发现,不管是肌内、瘤内还是静脉内注射,在异种移植HER2(+)肿瘤细胞的小鼠模型上均可观察到明显的肿瘤缩小和生命延长等现象。Eric等发现,转染了抗体-caspase-3嵌合蛋白的表达质粒的中国
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