冬凌草为唇形科香茶菜属植物,又名冰凌草,冬凌草甲素为其抗炎抗癌活性成分。目前冬凌草甲素的 测定方法只有高效液相色谱法<1,2>,为寻找一种简便、快速、试剂用量少的毛细管电泳定量 分析方法,作者以冬凌草片中冬凌草甲素为检测指标,探讨缓冲液的浓度、pH值、电压对有效成分迁移的影响,报道如下。1材料与方法1.1仪器与试剂P/ACEMDQ型高效毛细管电泳系统(Beckman公司,美国)及PACE工作站、紫外检测器,pHS-25型酸度计、CENTRIFUGE TDL-5型高速离心机,DZKW-4型电子恒温水浴锅,超声波洗涤器;甲醇,
乙醚,氢氧化钠 ,NaH2PO4·2H2O均为分析纯(天津化学试剂总厂);实验所用水均为超纯水;冬凌草 甲素标准品(郑州大学药物研究所提供);冬凌草片(河南济源市济世药业有限公司)。冬凌草甲 素储备液的配制:准确称取50mg冬凌草甲素标准品于50ml容量瓶中,甲醇定容,得1000mg/L冬凌草甲素储备液。1.2电泳条件1.2.1测定条件:石英毛细管33cm×75μmi.d(河北永年光纤厂);检测波长238nm;操作温度25℃;电压进样6.0kV×10s ;缓冲溶液NaH2PO4。1.2.2毛细管预处理:新的毛细管分别用1mol/L氢氧化钠 、1mol/L盐酸及超纯水冲洗30min。临用前,分别用0.1mol/L氢氧化钠、超纯 水及缓冲溶液冲洗5min、5min、15min后即可进样。之后,每次进样前仅用缓冲溶液 清洗毛细管3min。连续运行6次样品后,更换缓冲溶液。1.3冬凌草片样品溶液的制备精密 称取干燥恒重(去糖衣)的冬凌草片60片,研细后乙醚超声提取4次,每次用乙醚50ml超声 提取1h,离心、合并滤液后将溶液挥干,残渣用甲醇溶解,过滤定容至50ml,吸取4ml上 述溶液用体积分数90%甲醇稀释定容至10ml量瓶中,作为供试溶液,样品进样前经0.45 μm滤膜过滤。1.4分析条件的优化①缓冲溶液浓度:改变磷酸盐缓冲溶液的浓度使其依次为2 0mmol/L,30mmol/L,40mmol/L。②缓冲液pH值:改变磷酸盐缓冲液( 20mmol/L)的pH值(5.00,7.00,8.50,9.00)。③运行电压:考察 不同的运行电压(10kV,15kV,20kV,25kV)对分离的影响。1.5定量分析1 .5.1标准曲线的绘制:精密量取冬凌草储备液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0 ml、4.0ml、4.5ml置于10.0ml量瓶中,用体积分数90%甲醇稀释至刻度,摇 匀,得到系列浓度的对照品溶液,冬凌草甲素的质量浓度分别为50mg/L、100mg/L、 150mg/L、200mg/L、400mg/L、450mg/L,在选择的最佳电泳条件下 ,用外标法定量,并计算冬凌草甲素的峰面积(A)与质量浓度(C,mg/L)的线性方程。1 .5.2精密度试验:精密吸取供试品溶液,重复进样,将峰面积代入回归方程,求其含量,重复 5次。1.5.3稳定性试验:取供试品溶液放置1h、2h、4h、8h、24h,分别测定含 量。1.5.4加标回收试验:将冬凌草甲素对照品0.15mg、0.30mg、0.45mg 分别加入已知含量3.89mg的冬凌草样品溶液中,作加标回收试验,测定回收率,重复3次。 1.5.5样品测定:吸取样品溶液,用外标法测定样品中冬凌草甲素的含量,重复3次。2结果 2.1分析条件的优化①缓冲溶液浓度:当缓冲液浓度增加时,电流增加,焦耳热增加,使基线不 稳,选最佳浓度为20mmol/L。②缓冲溶液pH值:当pH值为5.00时,冬凌草甲素与 周围峰不能完全分离;当pH大于8.50时,冬凌草甲素峰与其后小峰重叠,综合考虑,最佳p H值为7.00。③运行电压:当电压为15kV时,分离效果最佳,故选择运行电压为15kV 。2.2定量分析2.2.1标准曲线:线性方程为A=270C-6538,r=0.9989 ,线性范围为50~450mg/L。2.2.2精密度试验:冬凌草甲素含量RSD=3.35 %。2.2.3稳定性试验:冬凌草甲素含量RSD=2.43%。2.2.4加标回收试验:冬 凌草甲素回收率为96.97%,RSD=1.03%。2.2.5样品测定:标示量的百分含量 为95.0%,RSD为3.85%。3讨论缓冲溶液的浓度不仅影响毛细管内表面的Zeta电 势,还影响溶液的黏度系数及分析物的扩散系数,最终影响分析物的分辨率和迁移时间<3>。本 研究中缓冲溶液浓度为20mmol/L,效果较好。提取所选溶剂为乙醚,这是考虑到制剂中的 有效成分冬凌草甲素在乙醚中有较好的溶解度,提取后的乙醚又易除去<4>,再者用乙醚提出的 杂质少。本研究中,作者曾用20mmol/L磷酸盐为缓冲液,纯甲醇溶解样品,上机测定,结 果冬凌草甲素不出峰,可能是由于冬凌草甲素是脂溶性药物,在进入毛细管时,析出结晶。故将磷 酸盐缓冲盐中加入体积分数10%甲醇,样品用体积分数90%甲醇溶解,结果较满意。总之,本法简便、快速、试剂用量少,效果好,值得推广。HPCE法测定冬凌草片中冬凌草甲素的含量@贾欣$郑州大学药学院!郑州450052
@高岩$郑州大学药学院!郑州450052
@杜斌$郑州大学药学院!郑州450052
@张秋荣$郑州大学药学院!郑州450052
@张振中$郑州大学药学院!郑州450052目的:探讨高效毛细管电泳法测定冬凌草片中冬凌草 甲素的方法。方法:样品用乙醚超声提取,缓冲液为20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH=7. 0,紫外检测波长238nm。结果和结论:线性范围为50~450mg/L,回收率为96. 97%,RSD为1.03%,该方法简便、快速且消耗试剂少,适于冬凌草片剂的质量控制。高 效毛细管电泳;;冬凌草片剂;;冬凌草甲素1鲁彦毫,吴卫新,白丽,等.HPLC法测定冬凌草片中冬凌草甲素的含量.中国药事,2001,15(1):47
2冀春茹,冯卫生,胡润淮,等.HPLC法测定冬凌草萜含片中冬凌草甲素的含量.中国现代应用药学,1999,16(5):35
3Chen G,Zhang JX,Jiannong Y.Determination of puerarin,daiazein and rutin in Pueraria lobata(Wild)Ohwi by capil-lary electrophoresis with electrochemical detection.J Chrom-atogr A,2001,923(1-2):255
4袁珂,胡润淮,张庆岭,等.冬凌草不同提取工艺的研究.中草药,1997,28(7):405舛ǘ璨葺坪卸璨菁姿氐暮?中国现代应用药学,1999,16(5):35
3Chen G,Zhang JX,Jiannong Y.Determination of puerarin,daiazein and rutin in Pueraria lobata(Wild)Ohwi by capil-lary electrophoresis with electrochemical detection.J Chrom-atogr A,2001,923(1-2):255
4袁珂,胡润淮,张庆岭,等.冬凌草不同提取工艺的研究.中草药,1997,28(7):405
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