蚂蚁属昆虫纲膜翅目蚁科,《本草纲目》称之为“玄驹”。蚂蚁虽小,但含人体所必需的多种营养物 质,包括多种氨基酸、微量元素及大量维生素、三萜类化合物。中医认为,蚂蚁具有扶正固本、补 肾壮阳、养血荣筋等作用犤1犦。蚂蚁种类繁多,全世界约有16000多种,我国估计达200 0种以上。目前临床应用的不到20种,其中已定名且常用入药的有10种蚂蚁,拟黑多刺蚁(鼎突多刺蚁Polyrhachisvicina R oger)是其中的1种犤2犦。本文观察以拟黑多刺蚂蚁粉为主要成分的某保健食品对小鼠细胞免 疫、体液免疫、单核-巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性的影响。现将实验方法及结果报道如下。 1材料与方法1.1材料1.1.1受试物由某公司提供,为褐色粉末。拟黑多刺蚂蚁粉占80% w(w/)。人体口服推荐剂量为1.6gd/,以每人60kg体重计算,折合剂量每日为0. 0267gk/g。1.1.2动物及饲养清洁级昆明种雄性小鼠80只,雌性小鼠40只,体质 量18～24g,由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场(动物生产许可证号为SCXK( 湘)2003-0003提供,在温度22～25℃、湿度52%～68%的环境中饲养,动物使用许可证号为SYXK(湘)2003-0002。1.1.3主要试剂绵羊红细胞S(R BC),H anks'液p(H 7.2-7.4),RPM I 1640培养液,小牛血清,青链霉素,刀豆蛋白AC(onA),M TT,补体(豚鼠血清),SA缓冲液,印度墨汁,都氏试剂,Y AC-1细胞,3H-TdR等。1.1.4主要仪器洁净工作台,二氧化碳培养箱,离心机,72 2分光光度计(北京产),液体闪烁仪(美国产),酶标仪(美国产),显微镜,游标卡尺等。1 .2方法1.2.1动物分组及给药方法实验分3大组,每大组40只小鼠。免疫1组(雄),测定迟发型变态(DTH)反应和抗体生成细胞数;免疫2组(雌),进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK 细胞活性测定;免疫3组(雄),进行碳廓清实验。每大组40只小鼠随机分为对照组,低、中、 高剂量组(剂量分别为0.133、0.267、0.800gk/g·d)组。对照组予以蒸馏水,灌胃体积0.2mL/10g,每天1次,连续灌胃30d。按文献<3>测定免疫功能指标。1.2.2细胞免疫功能测定①DTH实验采用足跖增厚法。每鼠腹腔注射0.2m L 2%v(v/)SRBC悬液。致敏后4d,测量左后足跖厚度,在测量部位皮下注射20%v(v /S)RBC(20uL/每鼠),24h后测量左后足跖肿胀厚度,连续测3次,取均值。以前后足跖厚度差值表示DTH程度。②ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验采用MTT法。无菌取脾,于无菌H anks'液中制成细胞悬液,200目筛网过滤,H anks'液洗3次。用RP-M I 1640培养液调整细胞浓度为5×106个m/L。而后分两孔加入24孔培养板,每孔1m L,一孔加50μL ConA液,一孔作对照,置5%二氧化碳,37℃培养72h。培养结束前4h,每孔吸去0.7m L上清液,加入不含小牛血清的R PM I 1640培养液和M TT(5m gm/L,50μL/孔)。培养结束后,每孔加入1m L酸性异丙醇,吹打混匀,波长570nm下用酶标仪测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加Co nA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。1.2.3体液免疫功能测定—抗体生成细胞检测采用Jerne改良玻片法。每鼠腹腔注射0.2mL 2%v(v/S)RBC悬液,免疫后4d,处死小鼠,取脾,用H anks液制成细胞悬液,200目筛网过滤,洗涤、离心2次,最后将细胞悬浮在5m L H anks液中。将表层培养基加热溶解后与等量pH 7.4、2倍浓度的H anks液混合,分装小试管,每管0.5m L,再向管内加入用SA液配制的10%SR BC 50μLv(v/)、20μL脾细胞悬液,迅淋巴细胞增殖能力O(D差值)速混匀后倾倒于已刷 薄层琼脂糖的玻片上,凝固后,放入二氧化碳培养箱中温育1.5h,加SA液稀释的补体(1: 10),继续温育1.5h后计数溶血空斑数。1.2.4单核-巨噬细胞吞噬功能测定小鼠碳廓清实验小鼠尾静脉注射0.1mL/(10g·d)以生理盐水稀释4倍的印度墨汁,立即计时,注入墨汁后第2、10m in,从内眦静脉丛取血20μL,加到2m L 0.1%Na2CO3溶液中,摇匀,600nm波长处测光密度值O(D)。处死小鼠,取肝、脾称重,计算吞噬指数a。1.2.5 NK细胞活性的测定采用同位素3H-TdR测定法。取传代后24h生长良好的YAC-1细胞,按1×106m/L YA C-1细胞悬液加3H-TdR10μCi进行标记,于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养2h后 ,用培养液洗涤3次,重悬于培养液中,使细胞浓度为1×105个m/L。处死小鼠,无菌取脾,制成脾细胞悬液,用Hanks'液洗3次,用完全培养液调整细胞浓度为1×107个m/L。96孔板中每孔加100 μL标记的靶细胞,试验孔加100μL效应细胞,空白对照孔加100μL培养液,最大释放孔加100μLTriton X-100。每个样品设3个复孔,置5%二氧化碳,37℃培养4h。用多头细胞取集器取集于玻 璃纤维滤纸上,用液闪仪测定每分钟脉冲数c(pm)。NK细胞活性=空白对照孔1-c实pm验-孔最c大pm释放孔cpm×100%。1.3统计学方法用Excel、Spss10.0软件进行数据转化 和统计分析。2结果2.1蚂蚁粉对小鼠细胞免疫功能的影响与对照组比较,3个不同剂量组小鼠经SRBC致敏、激发后的足跖肿胀度均显著增高P(<0.01或P<0.05);低剂量组小鼠Con A诱导的淋巴细胞转化能力显著增强P(<0.05)。见表1。表1蚂蚁粉对小鼠细胞免疫功能 指标的影响n(=10,x±s)各组小鼠碳廓清试验中的吞噬指数总体比较无显著性差异P(> 0.05)。见表3。表3蚂蚁粉对小鼠单核-巨噬细胞吞噬指数的影响n(=10,x±s)组别剂量g(k/g)吞噬指数a()对照组0.0005.47±0.83低剂量0.133 6.06±0.78中剂量0.267 5.80±0.82高剂量0.800 5.62±1.012.4蚂蚁粉对小鼠N K细胞活性的影响采用N K细胞活性的平方根反正弦转换值进行统计,结果显示高剂量组小鼠NK细胞活性显著高于对照组P(<0.05)。见表4。表4蚂蚁粉对小鼠N K细胞活性的影响n(=10,x±s)NK细胞活性组别剂量g(k/g)NK细胞活性(%)平方根反正弦转换值对照组0.000 18.0±12.1 23.9±9.5低剂量0.133 29.0±17.8 31.3±12.4中剂量0.267 27.7±13.2 31.3±8.1高剂量0.800 32.9±10.4 34.8±6.2注:与对照组比较P<0.05。3讨论蚂蚁被誉为“微型动物营养宝库”和“药 物加工厂”犤4犦12。蚂蚁粉中粗蛋白含量高达51.23%犤4犦12,含有20多种游离氨 基酸,其中包含除色氨酸外的人体必需氨基酸犤5犦;蚂蚁体内含有丰富的人体必需微量元素,尤以锌最多,每千克蚂蚁含锌高达1120mg,远高于其他动、植物犤6犦;还有多种维生素、三萜类化合物、多种生物碱、醛类化合物和性激 素等甾体化合物犤7犦。蚂蚁是保健食品的优良原料,具有双向免疫调节、缓解炎症、镇痛、催眠 、补肾壮阳、降低血糖、抗疲劳、清除自由基、延缓衰老等多方面的药理作用犤4犦14。我国有 学者以蚂蚁为君药,配以其它药材制成了蚂蚁乙肝宁、蚂蚁清风酒等复方制剂,并观察了其对小鼠 免疫功能的影响。结果发现,蚂蚁乙肝宁能增强细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫功能犤8犦。 蚂蚁清风酒犤9犦能使老年雄性ICR小鼠已萎缩的胸腺重量显著增加,胸腺指数明显升高,明显升高小鼠巨噬细胞吞噬指数及活性。采用ICR小鼠、2,4-二硝基氟苯(DNFB)致右耳廓肿胀DTH病理模型,发现蚂蚁清风酒对T细胞介导的DTH有明显的抑制作用犤 9犦。本文严格按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》犤3犦22-34,采用昆明种小鼠 ,对拟黑多刺蚂蚁粉对细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫功能、NK细胞活性的影响进行了全面 观察。结果发现,该蚂蚁粉能显著提高小鼠的迟发型变态反应,显著增强ConA诱导的小鼠淋巴 细胞转化能力,显著提高小鼠抗体生成细胞数和NK细胞活性。但对小鼠碳廓清单核-巨噬细胞吞 噬能力无明显影响。提示拟黑多刺蚂蚁粉具有提高细胞免疫、体液免疫功能、增强NK细胞活性作用,但对非特异性免疫力无明显的影响。邹梅等犤10犦也未见纯蚂蚁粉胶囊对对照组0.0000.20±0.09 0.013±0.010低剂量0.133 0.41±0.12 0.042±0.021中剂量0.267 0.35±0.11 0.016±0.009高剂量0.800 0.33±0.10 0.021±0.015注:与对照组比较P<0.05,P<0.01。2.2蚂蚁粉对小鼠体液 免疫功能的影响与对照组比较,低、中剂量组小鼠反映抗体生成细胞数的溶血空斑数显著高于对照 组P(<0.01)。见表2。表2蚂蚁粉对小鼠体液免疫功能指标的影响n(=10,x±s)组别剂量g(k/g)溶血空斑数(×103/全脾)对照组0.00014.5±5.3低剂量0.133 28.1±7.1中剂量0.267 27.5±7.7高剂量0.800 19.6±8.2注:与对照组比较,P<0.01。2.3蚂蚁粉对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响剂量组别g(k/g)注足射跖SR肿B胀C度后m(2m 4h)湖南中医学院学报2006年第26卷动物非特异性免疫功能产生影响。本文和前述蚂蚁制剂
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