微囊藻毒素对小鼠免疫功能的影响

藻类毒素对人体健康的影响已受到人们的高度重视。近年水体富营养化的危害日益严重,导致每年夏 秋季在一些淡水湖泊河流中发生大规模的水华现象,水质恶化,严重影响居民生活和经济发展<1 >。MacK-intosh<2>等研究发现,藻毒素的致毒机理是通过与蛋白磷酸酶中的丝氨 酸/苏氨酸亚基结合,抑制其活性,使哺乳动物肝细胞微丝分解、破裂和出血,导致肝充血,动物 失血休克而死亡。随着对藻毒素毒性研究的深入,发现微囊藻毒素具有多器官毒性、遗传毒性和致 癌性。由于外源化学物对免疫功能的影响往往表现在早期,因此免疫毒性检测作为机体的早期损害 指标之一,在外来毒物的危险性评价中的作用越来越重要<3>。关于微囊藻毒素(microc ystin,MC)对免疫系统的损害近几年也日益被许多研究者关注,孙露<4>等发现太湖水华微囊藻毒素可使脾脏肿大,降低小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖反应;AnnaLankoff<5>等人从体外试验中也发现了MC-LR对人和鸡免疫系统可以产生抑制作用, 这些研究均提示微囊藻毒素对免疫功能有抑制作用,但其具体机制尚不明确。福建地区水华时有发 生,本实验对福建水华微囊藻毒素的免疫毒性做进一步深入的研究,并探讨其可能的机制。1材料 和方法1·1实验动物健康成年ICR清洁级雄性小鼠40只,体重(20±2)g,由福建医科 大学实验动物中心提供。饲养环境:20~28℃,湿度(60±10)%,自由饮水进食,自然 光照。1·2试剂绵羊红细胞(SRBC)、补体(豚鼠血清)购自福建医科大学实验动物中心。 藻细胞裂解液由福建医科大学职业与环境卫生学系提供,藻浆2003年取自福州山仔水库,-2 0℃冰箱保存。临用前将藻浆解冻,经超声粉碎,高速离心,上清液为微囊藻毒素,分装后于-2 0℃冰箱保存,经高效液相色谱测定微囊藻毒素主要含40μg/ml的MC-LR,用时生理盐 水稀释至所需浓度。1·3实验方法取实验小鼠40只,按体重随机分成4组,即溶剂对照组和低 、中、高3个剂量微囊藻毒素染毒组,每组10只。各染毒组每日分别腹腔注射微囊藻毒素8μg/kg、16μg/kg、24μg/kg,对照组注射等量生理盐水,连续7d。于第8 d处死动物,摘眼球取血,取脾脏、胸腺和肝脏等进行指标的测定。1·3·1迟发性超敏反应<6>于染毒第3 d各组腹腔注射0·2 ml 20%的绵羊红细胞(SRBC)致敏,第7 d用游标卡尺测量小鼠左后肢足垫厚度后注入0·05 mlSRBC进行攻击,第8 d处死小鼠前测量左后肢足垫厚度。比较攻击前后足垫厚度差,求平均值。1·3·2白细胞计数和分类于染毒第7 d行剪尾采血,吸取0·02 ml血液于0·38 ml白细胞稀释液中,用血球计数板计数白细胞;另行血液涂片,甲醇固定再浸入Giemsa染色液中10 min,漂洗晾干,于油镜下数200个白细胞,计算淋巴细胞和中性粒细胞的百分比。1·3·3半数溶血值(HC50)<6>的测定于实验结束前4 d各组小鼠腹腔注射0·2 ml 20%SRBC致敏,第8d摘眼取血,分离血清。用生理盐水将血清稀释200倍,取稀释的血清1 ml于试管中,依次加入10%SR-BC和1∶10稀释的补体1 ml,以1 ml生理盐水代替血清样品作空白,37℃10 min水浴后立即将管移入冰浴中终止反应。2 000 r/min离心10 min,取上清液1 ml加都氏试剂3 ml,室温放置10 min。取10%SRBC 0·25 ml加都氏试剂3·75 ml于另一试管中室温放置10 min,以此作为SRBC的半数溶血值。将各管于540 nm处以对照管作空白,分别测定各管的OD值。1·3·4肝指数、脾指数和胸腺指数第8 d称重并处死小鼠,迅速取出于肝脏、脾脏和胸腺,生理盐水中漂洗,滤纸吸干后分别称重,计算肝 指数、脾指数和胸腺指数<器官重量(g)/体重(g)>×100。1·4数据统计分析方法采用SPSS11·5软件包对数据进行单因数方差分析。2实验结果2·1微囊藻毒素对小鼠脾指数和胸腺指数 的影响由表1可看出,与对照组相比,低剂量染毒组可使脾脏肿大(P<0·05),中高剂量染 毒组有使脾体比降低的趋势但无显著性;与对照组比较,3个染毒组的胸腺体比均有下降,高剂量 染毒组可使胸腺萎缩(P<0·05)。表1不同剂量MC-LR对各脏器指数实验的影响(-x±s)Table1 The effect of MC-LR on organ/body ratiosin ICR mice(-x±s)组别n脾指数胸腺指数8μg/kg 10 0·68±0·15*0·22±0·0516μg/kg 10 0·46±0·16 0·21±0·0524μg/kg 10 0·41±0·07 0·20±0·04*对照组10 0·45±0·09 0·25±0·05*与对照组比较,有统计学意义(P<0·05)。2·2微囊藻毒素对白细胞 计数和分类的影响由表2可看出,各染毒组可使白细胞数量显著下降(P<0·05),中高剂量 组淋巴细胞的比例降低(P<0·05),表明微囊藻毒素可通过降低白细胞数量和淋巴细胞的比 例,来抑制免疫功能。2·3微囊藻毒素对小鼠细胞免疫和体液免疫功能的影响由表3可看出,在 迟发性超敏反应和半数溶血值实验中,中高染毒组可使小鼠的足垫肿胀度和HC50下降(P<0 ·05),表明在微囊藻毒素的影响下,小鼠细胞免疫和体液免疫功能受到抑制。表2不同剂量MC-LR对白细胞计数和分类的影响(-x±s)Table2 The effect of MC-LR on lencocyte count andleukocyte differential count in ICR mice(-x±s)组别n白细胞计数(×108个/L)淋巴细胞的比例(%)8μg/kg 10 4·65±0·76*74·75±4·5616μg/kg 10 4·76±1·46*73·13±4·16*24μg/kg 10 4·56±1·04*68·38±4·53*对照组10 6·09±1·64 77·25±5·12*与对照组比较,有统计学意义(P<0·05)。表3不同剂量MC-LR对迟发性超敏反应和半数溶血值影响(-x±s)Table 3 The effect of MC-LR on the delayed typehypersensitivity and HC50 in ICR mice(-x±s)组别n迟发性超敏反应(cm)半数溶血值(HC50)8μg/kg 10 0·054±0·020 258·7±21·716μg/kg 10 0·043±0·009*216·4±38·324μg/kg 10 0·041±0·017*106·1±61·4*对照组10 0·070±0·020 293·5±61·8*与对照组比较,有统计学意义(P<0·05)。3讨论白细胞主要分3类 <7>:粒细胞、淋巴细胞与单核细胞,是机体重要的防御细胞之一。本研究发现微囊藻毒素可以 降低小鼠外周血白细胞的数量和淋巴细胞的比例,白细胞数量的减少往往表现为免疫功能低下,而 淋巴细胞比例下降则直接影响与抗原起特异反应的能力,导致免疫功能受到抑制。但是对微囊藻毒 素到底作用于哪种淋巴细胞或其亚群,哪种亚群的淋巴细胞更易感,还有待于进一步研究。迟发性 超敏反应<7>(DTH)主要是由CD4Th1细胞介导的以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为 主要特征的炎症反应,是机体细胞免疫功能的体现。研究发现中高剂量微囊藻毒素染毒组均可显著 抑制SRBC免疫小鼠的DTH,可见微囊藻毒素对小鼠的细胞免疫功具有明显的抑制作用;机体 的体液免疫功能主要通过抗体的作用来体现,本研究还发现:微囊藻毒素能降低SRBC免疫小鼠 的半数溶血值,提示微囊藻毒素也能抑制机体的体液免疫功能。孙露<4>等研究也发现MC导致 B细胞抗体应答能力明显下降。原因可能是MC一方面通过抑制巨噬细胞的吞噬功能,降低其对S RBC的摄取能力,进而抑制了巨噬细胞的抗原提呈能力,从而抑制T、B淋巴细胞的增殖活化; 另一方面通过直接抑制T、B淋巴细胞的增殖,达到抑制SRBC免疫小鼠DTH与溶血素生成的 目的。研究还发现低剂量染毒组可使脾脏肿大,中高剂量染毒组有使脾体比降低的趋势但无显著意 义;高剂量染毒组可使胸腺萎缩(P<0·05)。低剂量使脾脏指数升高,可能是低剂量引起脾 脏应激代偿性反应;随着剂量的升高脾脏指数开始下降,虽然与对照组没有显著差异,但可以推测 微囊藻毒素最终可使免疫器官脾脏和胸腺萎缩,导致免疫抑制。本文发现福建微囊藻毒素除了肝毒 性外,还可以对机体的细胞免疫和体液免疫有不同程度的抑制作用,其具体机制还需进一步研究。 本实验也证实微囊藻毒素是一种免疫毒性物质,而饮用水是人群暴露的最主要途径,因而其危险性 始终不容忽视。在日常生活中应加强宣传教育,尽量避免对微囊藻毒素的接触和摄入,以确保居民饮水安全。微囊藻毒素对小鼠免疫功能的影响@谢建忠$福建医科大学公共卫生学院!福州350004
@曾毅丹$福建医科大学公共卫生学院!福州350004
@汪家梨$福建医科大学公共卫生学院!福州350004
@陈铁晖$福建医科大学公共卫生学院!福州350004
@陈华$福建医科大学公共卫生学院!福州350004<目的>探讨微囊藻毒素(microcy stin,MC)对小鼠免疫功能的影响。<方法>清洁级ICR雄性小鼠40只随机分成4组, 各染毒组分别腹腔注射8μg/kg、16μg/kg和24μg/kg的MC-LR,对照组腹 腔注射等量生理盐水,连续7天,检测迟发型超敏反应(DTH)、半数溶血值(HC50)、白细胞计数和分类及脏器指数。<结果>与对照组相比,低剂量染毒组可使脾脏肿大(P<0.05)