动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发病机制至今未完全阐明,特别是高脂 血清中的低密度脂蛋白(LDL)被氧化修饰成氧化性LDL后,可通过各种途径促进AS的发生 和发展<1,2>。近年来,我们成功地从栀子中提取了西红花苷,发现其具有抗氧化、抗高脂血 症及抗AS<3,4>等作用。前期研究表明:西红花苷对氧化性LDL所致的内皮损伤有保护作 用<5>。在体内,氧化LDL来源于LDL的氧化,LDL是导致AS的主要脂蛋白。西红花苷 抑制LDL对内皮的损伤而发挥抗AS作用未见报道。因此,特采用培养的牛主动脉内皮细胞,研 究西红花苷对LDL所致内皮细胞损伤的保护作用,探讨西红花苷抗AS的作用机制。1实验部分 1·1材料西红花苷(Crocin,暗红色结晶,含量>90%,自制);RPMI-1640培养基(Gibco公司);新生牛血清(fetalbovine serum,FBS,杭州四季青生物工程公司);低密度脂蛋白(LDL,南京军区总医院);一 氧化氮(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(南京建成生物工程研究所);低密度脂蛋白胆固醇试剂盒(日本DaiichiPure Chemicals Co.,Ltd);脂必妥(Zhibituo,成都地奥集团,批号:0110023721); 葛根素(Gegensu,广东大日生化药业有限公司,批号:0005181);其余试剂均为分析纯。鹌鹑(中国药物大学实验动物中心),♂,95±10g,5~6周龄。1·2实验方法1·2·1主动脉内皮细胞的培养无菌条件下迅速取出新生乳牛的 胸主动脉,置于高抗的Hanks溶液中,洗掉残余血污,转移至培养皿中,采用胰蛋白酶消化法 取得内皮细胞,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养,置37℃、5%CO2培养箱中,约3d更换培养液,一周左右,细胞长至完全汇合时进行传代培养,采用生长良好的2代进行实验。1· 2·2对LDL诱导的内皮细胞损伤的影响内皮细胞以1×105cell·ml-1的密度接种于24孔板中,每孔0.5ml,培养至融合后,加入10-8、10-7、10-6mol·L-1西红花苷培养12 h后,换成含50μg·ml-1LDL的培养基继续培养24 h,吸取培养液,测定培养液中NO的含量,贴壁细胞用1%Triton溶解后,测定细胞中NO S的活性。实验分对照组(内皮细胞培养液中加0.5%FBS的RPMI-1640)、模型组(内皮细胞培养液中加0.5%FBSRPMI-1640和50μg·ml-1LDL作用24 h)、西红花苷组(实验前12 h在培养液中加不同浓度的西红花苷10-8、10-7、10-6mol·L-1,然后加50μg·ml-1LDL作用24 h)和葛根素组(实验前12 h在培养液中1 mg·ml-1葛根素,加50μg·ml-1LDL作用24 h)。1·2·3对高脂饮食鹌鹑血清LDL及NO的影响<6>鹌鹑普通饲料喂养适应一周后,按体重随机分为普食对照组,高脂模型组,西红花苷高、中、低剂量组(1005、02、5 mg·kg-1)和阳性药物对照组(脂必妥1 g·kg-1)日1。阳性药物与西红花苷,均为ig给药,每天一次。普食组喂基础饲料,其余5 组喂高脂饲料。高脂饲料处方为79%普通饲料、14%猪油、6%花生油、1%胆固醇。实验9 周末自颈静脉取血,分离血清,采用酶法测定LDL,试剂盒法测定NO含量。1·3统计数据以 x±s表示,采用t检验,P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有极显著性差异。1· 4结果1·4·1对内皮细胞培养液中NO含量的影响与对照组相比,50μg·ml-1LDL 组NO含量明显降低(P<0.05),而不同浓度的西红花苷使内皮细胞合成和分泌NO升高(P<0.01,表1)。表1西红花苷对内皮细胞培养液中NO含量的影响(x±s,n=8)Table1 Effects of crocin on NO in cultured calf aortic endothelial cells(x±s,n=8)Groups NO/μmol·L-1Control 109.17±7.57Model 94.59±5.49△Crocin 10-8mol·L-196.39±5.11Crocin 10-7mol·L-1107.13±7.82*Crocin 10-6mol·L-1122.16±11.30**Gegensu 105.33±5.61*Compared with control group:△P<0.05;compared with model group:*P<0.05,**P<0.011·4·2对内皮细胞中NOS活性的影响细胞用 1%Triton溶解后,测定细胞中NOS的活性。与对照组相比,50μg·ml-1LDL 组结构型NOS(cNOS)活性明显降低(P<0.01),而西红花苷组(10-71、0- 6mol·L-1)细胞内cNOS活性明显提高,与50μg·ml-1LDL组比较有显著差 异(P<0.01,表2),而3个浓度的西红花苷对诱导型NOS(iNOS)活性无显著影响 。葛根素组cNOS活性与50μg·ml-1LDL组比较明显提高(P<0.05,表2)。表2西红花苷对内皮细胞中NOS活性的影响(x±s,n=8)Table2 Effects of crocin on NOS in cultured calf aortic endothelialcells(x±s,n=8)Groups tNOS/U·mg-1iNOS/U·mg-1cNOS/U·mg-1Control 4.77±0.55 1.08±0.57 3.70±0.95Model 3.40±0.25△1.15±0.40 2.24±0.47△Crocin 10-8mol·L-14.06±1.24 1.21±0.82 2.86±1.04Crocin 10-7mol·L-14.84±0.66**1.38±0.62 3.45±0.44**Crocin 10-6mol·L-15.56±1.36**1.70±0.71 3.87±1.01**Gegensu 4.20±0.32**1.50±0.19 2.71±0.34*Compared with control group:△P<0.01,compared with model group:*P<0.05,**P<0.011·4·3对高脂饮食鹌鹑血清LDL及NO的影 响<8>高脂组鹌鹑的血清中LDL含量明显升高,而NO明显降低。给予西红花苷各剂量组的血 清中LDL显著降低,血清中NO的水平明显提高,结果见图1。图1西红花苷对鹌鹑血清LDL(A)和NO(B)的影响Fig1 Effects of crocin on LDL(A)and NO(B)level in atheroscleroticquails serum2讨论动脉粥样硬化(AS)是危害人类健康的常见疾病之一。其发生与发展与血脂和血 脂蛋白密切相关<7>。当血脂长期升高后,血脂及其分解产物,将逐渐沉积于血管壁上并伴有纤 维组织生成,使血管壁变厚、变硬,血管通道变窄,弹性减小,最后导致血管堵塞,形成AS和冠心病。体内研究表明,西红花苷(1005、02、5mg·kg-1)各剂量连续ig 9周,可防止高脂饮食所致的鹌鹑血清LDL升高及NO的降低,进而保护内皮的损伤,防止AS斑 块的形成。体内NO通过NOS催化L-精氨酸生成<8>。NOS分3种类型:Ⅰ型存在于神经细胞中,称为神经型NOS(neuronalNOS,nNOS);Ⅱ型存在于巨噬细胞和中性粒细胞中,称为诱导型NOS(inducible NOS,iNOS);Ⅲ型存在于内皮细胞中,称为内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)。eNOS和nNOS又称为组成型NOS(constitutiveNOS ,cNOS),其激活依赖于Ca2+和钙调素;而iNOS的激活不依赖于Ca2+和钙调素, 其表达主要在基因水平上接受调控。内皮细胞内NOS主要为cNOS,同时含少量的iNOS。 本研究发现,西红花苷可浓度依赖性地提高内皮细胞tNOS及cNOS的活性,使细胞合成及分 泌NO升高,而对iNOS的活性基本无影响。NO是血管舒张因子,能清除体内的自由基,与A S的发生与发展密切相关<8>。西红花苷能通过提高细胞内NOS的活性,升高NO含量而保护 内皮细胞不受损伤,进而发挥AS作用。西红花苷对低密度脂蛋白所致鹌鹑内皮细胞损伤的保护作用@何书英$中国药科大学生物制药教研室!江苏南京210009
@钱之玉$中国药科大学药理教研室!江苏南京210009目的探讨西红花苷对低密度脂蛋白(L DL)所致内皮细胞损伤的保护作用。方法在体外培养牛主动脉内皮细胞中,加入不同剂量的西红花苷培养12h后,再加入50μg.ml-1的LDL继续培养24 h,测定培养液中NO含量,测定细胞中一氧化氮合酶(NOS)的活性。在鹌鹑饮食性动脉粥样硬 化模型上,观察西红花苷连续9周预防性给药对血清LDL和血清NO的影响。结果西红花苷可浓 度依赖性地提高细胞内NOS的活性(P<0.01),使细胞合成分泌的NO含量升高(P<0 .01)。西红花苷能显著降低血清LDL水平,使血清NO含量提高。结论西红花苷对LDL所 致内皮细胞损伤有保护作用。西红花苷;;内皮细胞;;低密度脂蛋白;;一氧化氮合酶;;一氧 化氮<1>王保华,欧阳静萍,刘永明,等.当归对高脂血清所致ECV304细胞损伤的保护作用
.生理学报,2001,53(3):240
<2>严金川,吴宗贵,何松青,等.维生素E对氧化性低密度脂蛋白致大鼠主动脉平滑肌细胞毒性及增殖的影响.中国动脉硬
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