人类基因组计划(HGP)被誉为20世纪的3大科技工程之一。其划时代的研究成果———人类基 因组草图的完成宣告了一个新的纪元———“后基因组时代”的到来。其中,功能基因组学成为研 究的重心,蛋白质组学则是其“中流砥柱”<1>。药物是用于预防、治疗、诊断人类疾病的物质 。药物的研究与发现关系着人类的健康与生命的繁衍。蛋白质组学及其技术的发展,揭示蛋白质活 动规律,为发现新药提供了新靶点,也提高了药物发现的效率,如结构蛋白质组提供的三维结构, 结合组合化学、高通量筛选、计算机学和生物信息学,将促进药物靶点发现和验证、设计和产生新 的先导化合物和目的物<2>。本文将蛋白质组学及药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认以及药 物发现过程中有关技术和研究进展予以综述。1蛋白质组、蛋白质组学与药物蛋白质组学定义蛋白 质组(proteome)是指细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质。由于同一基因组在不同细 胞、不同组织中的表达情况各不相同,即使是同一细胞,在不同的发育阶段、不同的生理条件甚至 不同的环境影响下,其蛋白质的存在状态也不尽相同。因此,蛋白质组是一个在空间和时间上动态 变化着的整体。蛋白质组学(proteomics)是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一 门新兴科学,其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,了 解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。药物蛋白质组学包括基础 和临床研究两方面内容:基础研究主要包括新药和靶点发现、药物作用机制和毒理学等;临床研究 方面包括将疾病特异性蛋白质作为有效药物选择的依据和临床药物试验的标志以及对患者进行分类 和进行个体化治疗。2蛋白质组学和药物蛋白质组学研究的主要技术2.1蛋白质纯化Zelln er等<3>为了制备蛋白质组学分析的蛋白质,运用并比较了不同的沉淀法用于浓缩蛋白质和清 除干扰化合物的特点,认为蛋白质纯化的质量控制对保证蛋白质的纯度和结构完整是重要的。很多 蛋白质不溶解,而且结构不稳定,因此处理不当,用错误折叠的蛋白质作生化研究和药理活性筛选 将可能出现假阳性或假阴性的结果,不仅导致靶点鉴定的错误,而且也浪费时间和精力,错误信息还将污染数据库。2.2双向凝胶电泳技术双向凝胶电泳技术(Two-dimensionalgel electrophore-sis,2-DE)最先是由O'Farrell于1975年所描述 ,其原理是在相互垂直的两个方向上,分别基于蛋白质不同的等电点和分子量,运用等电聚焦电泳(Isoelectricfocusing,IEF)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)把复杂的蛋白质 成分分离和展现在二维平面上。该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质提取物,构建特定细胞或组 织蛋白质的二维电泳图谱,分析特定条件下蛋白质的表达状况,进行差异蛋白质组比较。高分辨率 的2-DE技术,它将电荷分离过程即等电聚集(IEF)与质量分离过程(SDS-PAGE) 结合到一起,以期获得细胞内的全部基因产物。其完整步骤应包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDS-PAGE、斑点染色、图像捕获和图谱分析等。2.3质谱技术质谱鉴定技术(Massspectrometry,MS)的引入是蛋白质组学发展中最重要的技术突破,该方法可以精确 测定由蛋白酶(通常用胰蛋白酶)水解多肽斑点后得到的几个肽段的质量。然后用这些肽段的质量查询数据库,如Genbank、PIR蛋白数据库、SWISSPROT数据库和EMBL<4>。蛋白质根据质量的精确度,一个未知的多肽一般可由5条肽段加 以鉴定。虽然,用少量的肽段不能完全清楚地鉴定一个蛋白质,但用串联质谱仪则可得到更为确切 的肽序列信息,一个肽的序列通常代表一个蛋白质。总之,应用自动化,增加灵敏度,提高通过量 ,改进生化分离和纯化蛋白质的方法,并与数据库相结合,已经扩展了质谱仪的应用。近年来,蛋 白质芯片<5>(或蛋白微阵列)技术、噬菌体展示文库技术逐渐趋于成熟,可以预计这些技术将 广泛用于蛋白质组学的研究。2.4生物信息学生物信息学是随着人类基因组计划、计算机技术和 网络技术的发展而诞生的一门新兴学科,是蛋白质组研究的一个不可缺少的部分,生物信息学在蛋 白质组研究中有两个重要应用:一是分析和构建双向凝胶电泳图谱,二是搜索与构建数据库。各种 不同类型的蛋白质组和基因组数据库既是实现已知蛋白质分析鉴定和未知蛋白质发展的前提,也是 分析蛋白质结构、性质和功能,实现模拟和预测的基础。用于蛋白质鉴定的数据库主要有以下几类 :蛋白质氨基酸序列数据库;蛋白质结构域与家族数据库;蛋白质高级结构及分类数据库;蛋白质 2-DE图谱数据库;蛋白质相互作用数据库。蛋白质组研究中使用的软件主要有以下几类:蛋白 质双向电泳图谱分析软件;蛋白质鉴定软件;蛋白质结构和功能预测软件<4>。3药物蛋白质组 学研究的主要内容3.1药物靶点的发现药物多是通过特异地作用于体内的靶蛋白质而重新调整患 者的生理状态达到治疗目的。新的药物靶蛋白质在药学研究中具有重要作用。目前,一些药物在体 内的作用机理并不清楚。应用蛋白质组学研究技术,分析药物处理过的细胞/组织或体液表达的蛋 白质组,并比较处理(治疗)前后蛋白质组的差异、鉴定其中发现相应变化的蛋白质,可揭示药物 的作用机理。Jiang等<6>运用蛋白质组学分析化疗药物治疗人类鼻咽部低分化鳞癌的抗增 殖机制时发现了6个有意义的蛋白质作用靶点。通过蛋白质组的对比研究,可以发现新的药物靶点 ,阐明药物个体化治疗的原因。Cheng等<7>对日本血吸虫蠕虫进行性别配对,运用双向电 泳和质谱技术进行蛋白质组学研究发现雌性蠕虫有12个特异蛋白质点,雄性有16个特异蛋白质 点,这些不同的蛋白质点表达的主要功能是在信号转导、新陈代谢和转录调节等方面,这样可以为 疫苗开发和治疗提供新的靶点。3.2药物靶点的验证和确认药物靶点的验证和确认在药物应用和 新药开发中具有重要作用。蛋白质-蛋白质相互作用的研究是药物靶点的验证和确认的较好方法, 它是众多细胞活动的关键过程,包括糖和脂代谢、细胞周期调节、蛋白质和核酸代谢、信号转导以 及细胞的骨架形成等。许多人类疾病如癌症、自身免疫疾病、病毒感染等都与蛋白质间相互作用的 衰竭或紊乱有关。因而完全阐明人类疾病蛋白质与其它已知或未知蛋白质的相互作用,将全面揭示 治疗干预的靶点。最常用的在蛋白质组规模发现蛋白质-蛋白质相互作用的技术是酵母双杂交系统 ,用这套系统已经发现了许多新的蛋白质相互作用。尽管该方法有很大潜力,但也有显著的缺点: (1)它对每一种可能的相互作用都会产生数种假阳性,而实验中区分假阳性是耗时而困难的;( 2)基因组范围内作双向杂交筛选有局限性;(3)能够描述的只是两个蛋白质分子的相互作用, 大量集中存在的蛋白质难于采用双杂交分析<8>。Greenblatt等于1991年发展起 来的蛋白质亲和层析色谱法研究蛋白质-蛋白质相互作用,可以补充酵母双杂交系统。这种蛋白质 亲和层析法,虽然需要纯化蛋白质,但它很少产生假阳性且适合于高通量筛选。该技术是将待纯化 的蛋白质固定在一个固相支持物上,然后与它结合的蛋白质或小分子,可通过凝胶电泳和质谱鉴定 ,这种方法已经在原核和真核系统用于发现蛋白质-蛋白质相互作用。另外,最近发展了利用网络 来设计药物,并对多靶位药物的功效进行鉴定<9>,也有采用蛋白质芯片<5>(或蛋白微阵列 )技术、噬菌体展示文库技术及蛋白质序列分析<10>来研究蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质 组学。3.3药物的毒理作用和安全性评价蛋白质组学可用于药物毒理学研究和安全性评价。比较 正常组织细胞和药物处理后的组织细胞的差异蛋白质组,寻找药物所具有不良作用的蛋白质结构, 并对其进行改进和修饰<8>。Steiner等<11>通过环孢菌素A对小鼠肾脏组织影响的 蛋白质组学研究,发现用药后小鼠肾脏组织蛋白质组中的钙结合蛋白CalbindinD28( 细胞内的一种钙转运蛋白)消失,肾小管钙累积,从而阐明了环孢菌素A肾毒性机理。Nordv arg等<12>运用动物实验对药物进行了吸收、分布、新陈代谢、排泄和毒性的对照蛋白质组 研究,发现差异蛋白质可以用于药物代谢研究的靶点或者作为毒性的标志。运用蛋白质组学技术还 可以对具体药物含量进行测定,如对吗啡药物依赖性患者的吗啡含量进行测量<13>、烟碱治疗 后纹状体烟碱含量测定<14>及蝰蛇蛇毒的分析<15>等。另外,进行已知药物毒理学蛋白质 组分析,可以鉴定和积累特定组织损伤的蛋白质标志物,为药物临床前安全性评价提供指标,实现 新药毒性预测,减少药物临床试验的风险。3.4药物的筛选和新药发现药物的筛选是发现新药有 效的方法,也是新药发现的源头和起点。化学蛋白质组是通过检测活性来验证可能的靶点,或通过 筛选小分子配体与蛋白质结合,描述新蛋白质的功能,或用确定的化学探针去研究生物学的一门研 究方法<8>。目前,组合化学技术的成熟可以大量提供新药开发的新化合物。化学蛋白质组学方 法则可以明显改变药物发现的难点--靶点的验证和确认。用纯化的蛋白质或含有这些蛋白质的提 取物进行筛选。Weingarten等<16>在免疫治疗中运用蛋白质组学技术发现蛋白质点 可以为药物靶点的选择和新药发现提供依据。可用核磁共振光谱法(NMR)<17>,微量热量 计法,或芯片技术<5>(微阵列法),蛋白质序列测定<10>,或通过筛选新蛋白质与不同的 化合物库作用而发现新的配体。新近发展和改进的高通量柔性分子对接技术,使计算机方法在先导 化合物发现中的作用大大增加,快而准确的计算机方法可以预示任意分子的结合亲和性,虽然目前该方法仍有缺陷,但分子对接和筛选方法能从商品化合物和合成的化合物库中筛选出可能的先导化合物。4展望随着人类基因组计划的完成,期望蛋白质组学能对后基因计
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