色素增多性皮肤病是临床上的一类常见皮肤病,寻找抑制黑素生成的天然脱色剂是目前研究的热点。 黑素的生成除了主要与酪氨酸酶有关外,还与自由基作用密切相关1-3。在我们以往的实验中, 发现光果甘草等21味中药乙醇提取物对酪氨酸酶有较强的抑制作用4。本研究中测定其SOD样 活性以进一步观察它们对自由基作用的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1药材光果甘草、 败酱草、苍耳子、茶条槭(干)*、茶条槭(鲜)*、蝉衣、炒川断、地骨皮、甘草、黄杨*、苦 参、连翘、六月霜*、牡丹皮、泥糊菜*、桑树*、生大黄、金银花、天麻、五倍子、珍珠绣线菊 *(药材名后带“*”者为自采植物),其余均为中药饮片,购自南京药业股份有限公司中药材分 公司。所有药材均由江苏省中国科学院植物研究所郭荣麟教授鉴定。1.1.2试剂熊果苷(纯度 >98%),北京贝丽莱日用化工厂提供;次黄嘌呤(分析纯),Sigma公司;盐酸羟胺(分 析纯),广东西陇化工厂,汕头;无水对氨基苯磺酸(分析纯),中国医药上海化学试剂公司;N -1-萘乙二胺盐酸盐(分析纯),天津市化学试剂研究所;乙酸(分析纯),南京化学试剂厂; 超氧化物歧化酶(SOD),Sigma公司,来自牛红细胞;黄嘌呤氧化酶,Sigma公司。 1.1.3仪器752紫外分光光度计,上海第三分析仪器厂;可控硅控温水浴锅,通州市泸通实验仪器厂;离心机,北京医用离心机厂制造。1.2方法1.2.1受试物的制备切碎植物并称取50g原生药,用80%乙醇浸泡2次(自采植物新鲜组的首次浸泡用90%的乙醇),每次浸泡5天, 将2次滤液合并后置于沸水浴上减压蒸馏浓缩至稠膏状。此后进行真空干燥处理,即得,冰箱中冷藏备用。实验时用PBS稀释成一定浓度的受试物2,3。1.2.2SOD样活性的测定先将0.2 mL反应物A溶液(0.5 mmol次黄嘌呤,10 mmol盐酸羟胺)和0.8mL受试物溶液<用EDTA-PSB(pH 8.2)溶解受试物,使其受试物浓度分别为2 mg/mL,10 mg/mL,50 mg/mL>,在37℃下培养10 min,接着将0.2 mL黄嘌呤氧化酶溶液(5 mU/mL)加入到上述溶液中,并将该混合物培养30 min。然后将2 mL反应物B(终浓度为20μmol N-1-萘乙二胺盐酸盐,2 mmol对氨基苯磺酸,16.7%醋酸)加入到上述混合物中,在室温下维持30min,用分光光度计在550 nm处测定吸光度A值。SOD样活性用抑制次黄嘌呤氧化酶催化所产生的超氧阳离子的百分比表示 。用来自牛红细胞的SOD作为阳性对照组,以PBS代替受试物作为空白对照2,3。1.2.3数据处理和统计方法以-x±s表示,上述每一试验重复3次。所测试验数据用SPPS10.0统计处理,配对计量资料采用t检验进行统计学分析。2结果结果表明,本试验中光果甘草 等21味中药均有不同程度的SOD样活性。其中以败酱草、牡丹皮、茶条槭(鲜)、六月霜等的SOD样活性最强(表1)。表121味中药提取物的SOD样试验结果(-x±s)受试物浓度(mg/mL)A(×1000)抑制率(%)空白对照150±6败酱草2 124.3±2.8 14.8±1.910 86.1±2.2 40.1±1.550 28.1±3.7 78.6±2.5a苍耳子2 124.7±1.5 15.4±1.010 82.1±2.1 43.4±1.450 47.4±1.6 66.8±1.1b茶条槭(干)*2 123.6±3.0 15.4±2.010 84.1±1.0 42.1±0.750 49.3±4.0 64.6±2.6b茶条槭(鲜)*2 129.0±1.1 13.2±0.710 80.8±0.5 45.4±0.350 31.3±1.4 78.2±0.9a蝉衣2 128.3±1.7 13.2±1.110 86.0±0.8 41.6±0.550 45.2±2.1 68.4±1.4b炒川断2 120.6±1.9 17.1±1.210 82.0±3.7 41.8±2.550 51.2±2.3 63.1±1.5b地骨皮2 124.7±2.9 14.6±1.910 86.6±1.5 40.1±1.050 37.2±3.8 72.6±2.6b甘草2 123.0±0.3 17.4±0.210 80.7±1.4 45.2±0.950 43.7±0.5 70.2±0.3b光果甘草2 125.6±1.8 15.2±1.210 83.4±0.3 43.6±0.250 36.8±2.3 74.2±1.5b黄杨*2 122.2±1.3 17.1±0.910 80.8±4.0 43.2±2.750 53.6±1.2 62.8±0.8b苦参2 124.4±1.1 15.1±0.810 74.0±3.7 47.6±2.550 40.6±1.5 70.8±1.0b连翘2 120.7±1.9 17.8±1.310 75.1±2.5 47.8±1.750 47.4±2.6 66.4±1.7b六月霜*2 122.5±2.9 15.6±2.010 76.6±2.5 46.1±1.750 29.7±3.7 77.1±2.5a牡丹皮2 128.4±1.1 13.4±0.710 82.9±1.8 43.2±1.250 30.5±1.1 78.6±0.7a受试物浓度(mg/mL)A(×1000)抑制率(%)泥糊菜*2 121.5±0.6 17.8±0.410 90.9±2.7 37.4±1.850 48.4±0.9 66.4±0.6b桑树*2 122.7±0.7 17.1±0.510 90.6±4.3 37.4±2.850 33.9±1.1 76.2±0.7b生大黄2 125±1.4 14.8±0.910 74.7±2.7 47.6±1.850 52.7±1.7 62.8±1.1b金银花2 122.6±0.2 17.6±0.110 92.2±2.2 37.2±1.550 40.6±0.3 72.2±0.2b天麻2 121.1±2.0 17.6±1.410 84.6±1.7 41.8±1.150 35.5±2.7 74.4±1.8b五倍子2 123.3±3.3 15.2±2.210 86.6±2.9 40.1±1.950 41.9±4 69.1±2.7b珍珠绣线菊*2 126.7±1.3 14.1±0.910 86.8±4.0 39.2±2.750 50.6±1.2 64.8±0.8b熊果苷0.002 mmol 144.4±0.8 2.6±0.50.01 mmol 142.7±2.0 3.2±1.30.05 mmol 142.3±2.2 3.9±0.7SOD 0.01 U/mL 124.3±2.2 15.1±1.50.02 U/mL 59.1±2.9 58.3±1.90.04 U/mL 30.0±2.4 77.8±1.6注:a抑制率与0.02 U/mL的SOD相比有高度差异显著性(P<0.01)b抑制率与0.02 U/mL的SOD相比有差异显著性(P<0.05)。3讨论黑素的生成过程是一个较为复杂的过 程,该过程除与酪氨酸酶有关外,还与自由基等因素密切相关1-3。研究表明,酪氨酸酶的催化 作用和多巴醌及其以后的自动氧化反应均需自由基的参与,自由基数目增加会加速黑素生成,自由 基数目减少则可减少黑素的生成,因此自由基在整个黑素合成过程中起着重要作用5。目前市场上 流行的具有美白作用的超氧化物歧化酶(SOD)就具有清除自由基的作用,其作用机制如下:O 2-+O2-+2H+SODH2O2+O2国外常用SOD样活性试验作为筛选酪氨酸酶抑制剂 的另一个重要指标2,3。因此,我们对光果甘草等对酪氨酸酶有较强抑制作用的21味中药又进 行了SOD样活性的研究。本次试验结果表明,败酱草(78.6%)、牡丹皮(78.6%)、茶条槭(鲜,78.2%)、六月霜(77.1%)等在高浓度时的抑制率与0.02U/mL的SOD(阳性对照组,中国麻风皮肤病杂志2006年2月第22卷第2期58.3%) 相比有高度差异显著性(P<0.01),而桑树(76.2%)、天麻(74.4%)、光果甘 草(74.2%)、地骨皮(72.6%)、金银花(72.2%)、苦参(70.8%)、甘草 (70.2%)、五倍子(69.1%)、蝉衣(68.4%)、苍耳子(66.8%)、连翘( 66.4%)、泥糊菜(66.4%)、珍珠绣线菊(64.8%)、茶条槭(干,64.6%)、炒川断(63.1%)、黄杨(62.8%)、生大黄(62.8%)等在高浓度时的抑制率与0.02U/mL的SOD(阳性对照组,58.3%)相比有差异显著性(P<0.05)。本试验中的阳 性对照物SOD的SOD样活性与国外文献报道基本相符2,3。熊果苷具有较强的酪氨酸酶抑制 作用6,7,是筛选酪氨酸酶抑制剂的一种常用的阳性对照物。本试验发现熊果苷的SOD样活性 极弱,该结果与国外文献报道相一致2,3。以上分析表明,光果甘草等21味中药除了有较好的 酪氨酸酶抑制作用4外,同时还有不同程度的SOD样活性,说明这些中药对黑素生成的抑制作用 可能是多靶点作用的综合效应。这提示我们在开发脱色剂和治疗色素障碍性疾病时应注意选择有多 靶点作用的原粒。当然,由于本次试验用的原料是中药乙醇提取物,其成份极为复杂,目前尚无法 判断这21味中药乙醇提取物对酪氨酸酶抑制作用和SOD样活性是同一成分还是多种成分(包括 鲜药提取物中的色素)作用所致,同时也无法判断反应物与受试验结合进行培养后是否会对中药成 分产生影响,故有必要分离出单体作进一步深入研究。致谢:本试验所用的中药由江苏省中国科学院植物研究所郭荣麟教授鉴定。21味中药乙醇提取物的超氧化物歧化酶样活性的研究@
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