大量的研究表明 ,肿瘤坏死因子 (TNF)在骨质疏松发生中起着非常重要的作用。本实验以卵巢切除所致的骨质疏松大鼠为模型 ,主要观察补肾健骨方对外周血清中TNF α含量的影响 ,以探讨该药治疗骨质疏松症的机理。1 材料与方法1 1 实验动物选用Wistar大鼠 5 0只 ,雌性 ,清洁级 ,体重 2 0 0g～ 2 4 0g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供 ,许可证号 :SCXK(京 ) 2 0 0 2 0 0 0 3。在本所清洁级实验动物室饲养 ,适应性喂养 1周后用于实验。1 2 分组及处理将大鼠随机分为 4组 ,即假手术组 (12只 )、
模型组 (13只 )、骨疏康组 (12只 )和补肾健骨方组 (13只 )。模型制作 :将大鼠以 4 5mg kg体重的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 ,腹位固定。在其最末肋骨下 ,腋中线与距脊柱外侧约 1cm之交叉处 ,剪去鼠毛。以70 %的酒精以及碘酊消毒 ,切开皮肤、背部肌肉和腹膜 ,以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外 ,分离脂肪团 ,便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎 ,然后摘除卵巢。切口缝合后 ,外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢 ,假手术组只切取小块脂肪组织 ,而不摘除卵巢。大鼠在切除卵巢 3个月后 ,补肾健骨方组灌胃给予自拟的中药复方水煎剂 0 2 8g ml,给药体积为1ml 10 0g体重 ,给药剂量为 2 8g生药 kg体重 ;骨疏康组灌胃给予药液浓度为 0 131g ml的骨疏康 (东港市康辰制药有限公司产品 ) 1ml 10 0g体重 ,给药剂量为 1.31g kg体重。以上给药 1d 1次 ,连续 6d ,休息1d后 ,再连续 6d ,如此给药 3个月。假手术组、模型组分别灌胃给予等体积的蒸馏水。各组大鼠于处死前 18d和前 3d分别腹腔注射盐酸四环素 30mg kg体重 ,以对骨进行荧光标记。给药 3个月后 ,将各组大鼠处死 ,取血清用于TNF α的测定 ;取出胫骨 ,进行不脱钙骨切片。1 3 观察指标的测定方法1 3 1 骨组织形态计量学指标的测定 取大鼠左侧胫骨近端 1/ 3,去除软组织 ,并磨去左右两侧部分皮质。按照刘绍泉的方法进行塑料包埋<1> 。在Reicheit Jung 2 0 4 0切片机 (德国 )上 ,用钨钢刀分别切出 5 μm的纵向不脱钙骨切片。将切片先置于甲基丙烯酸甲酯中 2h ,二甲苯中 2次各 1h ,溶掉树脂 ,梯度乙醇至水 ,甲苯胺蓝染色。采用LeicaQwin图像分析系统进行骨组织形态计量。骨小梁体积百分比 (TBV % ) :骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比 ,是骨量水平的主要标志。骨小梁吸收表面百分比 (TRS % ) :不规则、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比。骨小梁形成表面百分比 (TFS % ) :有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比。骨小梁矿化率 (MAR) :骨小梁表面荧光双标记带的平均距离除以两次标记相隔的天数。骨皮质矿化率 (mAR) :皮质内表面双标记带的平均距离除以两次标记相隔的天数。1 3 2 TNF α含量的测定 用放射免疫分析法测定大鼠外周血清中TNF α的含量 ,放免药盒由北京北方生物技术研究所提供。1 4 统计方法实验数据以均数±标准差 ( x±s)表示 ,采用SPSS 10 0软件对其进行方差分析。2 结果2 1 补肾健骨方对卵巢切除大鼠胫骨TBV %的影响模型组大鼠胫骨TBV %显著低于假手术组。补肾健骨方组、骨疏康组的TBV %均显著高于模型组 ,而明显低于假手术组 (见表 1)。表 1 各组大鼠胫骨TBV %的变化组别nTBV %假手术组 12 2 3 .0 3± 4.79模型组 13 8.5 1± 2 .3 3 骨疏康组 12 14 .0 2± 2 .96 △△补肾健骨方组 13 18.10± 3 .93 △△注 :与假手术组比较 : P <0 0 5 , P <0 0 1;与模型组比较 :△△ P <0 0 12 2 补肾健骨方对卵巢切除大鼠胫骨TRS %的影响与假手术组相比 ,模型组大鼠胫骨TRS %显著增高。补肾健骨方组的TRs %显著低于模型组 ,而与假手术组相比 ,无显著性差异。骨疏康组的TRS %显著高于假手术组 ,但低于模型组 (见表 2 )。2 3 补肾健骨方对卵巢切除大鼠胫骨TFS %、MAR的影响模型组大鼠胫骨TFS %、MAR较假手术组皆显著增高。与模型组相比 ,补肾健骨方组的TFS %、MAR皆显著降低 ;而与假手术组相比无显著性差异。与假手术组相比 ,骨疏康组的TFS %、MAR均明显增高 ;而与模型组相比 ,TFS %和MAR明显降低(见表 3)。表 2 各组大鼠胫骨TRS %的变化组别nTRS %假手术组 12 3 .2 6± 1.0 9模型组 13 8.2 9± 2 .2 0 骨疏康组 12 4.65± 1.3 7 △△补肾健骨方组 13 3 .12± 0 .91△△注 :与假手术组比较 : P <0 0 5 , P <0 0 1;与模型组比较 :△△ P <0 0 1表 3 各组大鼠胫骨TFS %、MAR的变化组别nTFS %MAR(μm d)假手术组 12 4.2 3± 1.5 5 0 .82± 0 .2 3模型组 13 12 .82± 2 .2 9 1.71± 0 .3 0 骨疏康组 12 5 .93± 1.66 △△ 1.2 6± 0 .2 9 △补肾健骨方程 13 4.47± 1.0 8△△ 0 .90± 0 .2 2 △△注 :与假手术组比较 : P <0 0 5 , P <0 0 1;与模型组比较 :△ P <0 0 5 ,△△ P <0 0 12 4 补肾健骨方对卵巢切除大鼠胫骨mAR的影响模型组大鼠胫骨mAR显著高于假手术组。补肾健骨方组的mAR显著低于模型组 ;而与假手术组相比无显著性差异。骨疏康组的mAR明显高于假手术组 ,而低于模型组 (见表 4 )。表 4 各组大鼠胫骨mAR的变化组别nmAR(μm d)假手术组 12 1.5 4± 0 .2 9模型组 13 2 .60± 0 .5 1 骨疏康组 12 1.96± 0 .41 △△补肾健骨方组 13 1.46± 0 .3 0 △△注 :与假手术组比较 : P <0 0 5 , P <0 0 1;与模型组比较 :△△ P <0 0 12 5 补肾健骨方对卵巢切除大鼠外周血清中TNF α含量的影响与假手术组比较 ,模型组大鼠外周血清中TNF α含量显著增高。与模型组比较 ,补肾健骨方组的TNF α含量明显降低 ,而与假手术组比较无显著性差异。骨疏康组的TNF α含量明显低于模型组 ,但高于假手术组 (见表 5 )。表 5 各组大鼠外周血清中TNF α含量的变化组别nTNF α(fmol ml)假手术组 12 4.88± 1.0 5模型组 13 7.44± 1.0 3 骨疏康组 12 6.2 8± 1.2 1 △补肾健骨方组 13 5 .17± 1.2 3 △△注 :与假手术组比较 : P <0 0 1;与模型组比较 :△ P <0 0 5 ,△△ P <0 0 1 (下转第 18页 )(上接第 33页 )3 讨论骨组织形态计量学研究结果显示 ,大鼠切除卵巢后 ,作为骨量主要标志的胫骨TBV %显著降低 ,而代表骨吸收参数的TRS %以及代表骨形成参数的TFS %、MAR和mAR皆显著增高 ,表明卵巢切除所造成的是一种骨吸收大于骨形成的高转换型骨质疏松模型。这与国内外的报道相一致。给去卵巢大鼠灌服补肾健骨方后 ,能使上述指标发生逆转 ,表明该药对卵巢切除所致的骨质疏松症有明显的治疗作用。大量的研究证实 ,肿瘤坏死因子 (TNF)在骨质疏松发生中起着非常重要的作用。其可以使破骨细胞的皱边和透明区增大 ,即激活破骨细胞<2 > 。体外实验显示 ,TNF α在有成骨细胞或成骨细胞培养上清液存在的情况下 ,可使破骨细胞的骨吸收能力提高 2～ 3倍<3 > 。有人发现 ,将重组TNFs与胎鼠骨进行培养 ,在浓度为 10 -7mol L～ 10 -9mol L时 ,在体外可引起破骨细胞的骨吸收<4> 。本实验结果显示 ,切除大鼠卵巢后 ,外周血清中TNF α含量显著增高 ,而给大鼠灌服补肾健骨方后 ,TNF α含量明显降低。这一结果表明 ,能使TNF α含量降低是补肾健骨方能够治疗骨质疏松症的机理之一。补肾健骨方对卵巢切除所致骨质疏松大鼠外周血清中TNF-α的影响@李昌龙$江苏济川医药集团!江苏泰兴225441
@鞠大宏$中国中医研究院基础理论研究所!北京100700
@张丽坤$中国中医研究院基础理论研究所!北京100700
@赵宏艳$中国中医研究院基础理论研究所!北京100700
@刘梅洁$中国中医研究院基础理论研究所!北京100700补肾健骨方;;
骨质疏松;;TNF -α目的:探讨补肾健骨方治疗骨质疏松症的机理。方法:切除大鼠的双侧卵巢造成骨质疏松模型 。采用骨组织形态汁量学方法对胫骨不脱钙骨切片进行形态计量;采用放射免疫分析方法测定大鼠外周血清中TNFα的含量。结果:切除大鼠卵巢后,胫骨TBV %显著降低,而TRS %以及TFS %、MAR和mAR皆显著增高,表明卵巢切除所造成的是一种骨吸收大于骨形成的高转换型骨质疏松模型。而补肾健骨方能使上述指标发生逆转。同时,大鼠外周血清中TNF α含量显著增高,而该方能使之降低。结论:补肾健骨方对卵巢切除所致的骨质疏松症
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