脑泰方是治疗脑梗死的有效方剂 ,临床和实验研究结果显示 ,该药对急性脑梗死患者疗效显著 ,与尼莫地平基本一致 ,尤其在恢复神经功能缺损和临床症状方面作用显著 ;对脑梗死大鼠海马区神经细胞损害和皮质区血管周围炎性细胞浸润有明显保护作用 ,对体外培养的血管内皮细胞具有较好的保护作用。本研究通过观察脑泰方提取物预处理沙土鼠脑缺血再灌注损伤中脑组织海马CA1区神经元损伤情况 ,初步探讨一种提高脑缺血耐受能力的预处理中药制剂 ,并在中药防治脑血管疾病的药物性预处理方面进行有益的尝试1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 成年蒙古沙土鼠 ,9～ 12周龄 ,5 0～90 g ,清洁级 ,雌雄不拘 ,购自湖南省卫生防疫站实验动物中心。1.1.2 药物 脑泰方提取物 ,脑泰方原方由黄芪、川芎、地龙等药物组成 ,由本院药学院制剂教研室经水煎、醇提后制备成浸膏粉 ,每 1g浸膏粉含生药 4g。用时以纯净水稀释成 4 0 %浓度 (每ml药液含生药1.6 g)。1.1.3 主要试剂 苏木素 :化学纯 (上海化学试剂站分装厂 ,批号 :980 6 16 ) ;伊红Y :化学纯 (广州化学试剂厂 ,批号 :810 30 6 )。1.1.4 主要仪器 切片机 :Shandon ,英国产 ;OLYMPUS显微镜 ,日本产。1.2 实验方法1.2 .1 实验分组 沙土鼠随机分为 13组 :假手术组 (A)、脑缺血再灌注组 (模型组 ) (B)、脑缺血预处理组 (C)、药物预处理组 (D)。其中B、C、D组依再灌注不同时相各分 4个亚组 ,每亚组 5只沙土鼠。1.2 .2 造模方法 参照文献方法<1> ,沙土鼠在2 2℃环境温度中实验 ,2 5 %乌拉坦 2 0mg/kg腹腔注射麻醉 ,仰卧固定 ,作颈正中切口 ,分离暴露双侧颈总动脉 ,麻醉减浅后 ,除假手术组外 ,脑缺血模型均以微动脉夹夹闭双侧颈总动脉 15min造成。其中缺血预处理方法是以无创伤微动脉夹夹闭双侧颈总动脉 ,造成全脑缺血 3min后松开动脉夹 ,此次缺血即为预处理过程。经预处理的实验组于 2 4h后再行夹闭双侧颈总动脉 ,时间为 15min ,此次缺血即为脑缺血损伤过程。 15min后松开微动脉夹行再灌注 ,缝合皮肤 ,继续饲养。假手术组分离但不结扎双侧颈总动脉。实验过程中 ,用白炽灯照射沙鼠以维持肛温在 37℃左右 ,直到恢复活动。夹闭前后观察沙土鼠脑电波及瞳孔变化等 ,以判定是否产生脑缺血。其他操作按各分组情况进行。1.2 .3 给药方法及实验方法 按实验设计方法 ,脑泰方提取物配成 4 0 %浓度溶液 ,给药及实验流程如下 :(1)假手术组 :手术暴露双侧颈总动脉 ,不结扎 ,3min后缝合颈部皮肤 ;2 4h后再次暴露双侧颈总动脉 ,不结扎 ,15min后缝合皮肤 ,按要求取脑组织待测。 (2 )模型组 :手术暴露双侧颈总动脉 3min后缝合 ,2 4h后再次暴露双侧颈总动脉 ,麻醉减浅后 ,用无创微动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉 ,15min后松开动脉夹恢复颈动脉血流 ,于再灌注 2 4h、4 8h、72h和 7天后分次处死。 (3)脑缺血预处理组 :除第 1天分离暴露双侧颈总动脉 ,并行脑缺血 3min外 ,其余操作步骤同模型组。 (4 )药物预处理组 :于缺血损伤前 2 4h给予脑泰方提取物稀释液灌胃 1次 ,给药剂量为 16g生药 /kg体重 ,相当于临床等效剂量的 1.5倍。其余步骤同模型组。1.2 .4 观察指标及方法 沙土鼠处死后迅速取脑组织待测。其中 5只未注射伊文思蓝的沙土鼠的脑组织经HE(苏木素—伊红 )染色后供病理形态学观察用。1.2 .5 统计方法 计量资料以均数±标准差 ( x±s)表示 ,在SPSS10 .0统计软件上采用方差分析或成组t检验进行数据处理。2 结 果2 .1 对海马CA1区存活神经元数目的影响 再灌注 2 4h后 ,模型组存活神经元数目明显低于假手术组 (2 2 3.8± 7.6 6 ) (P <0 .0 5 ) ,且随着再灌注时间延长 ,各组海马CA1区存活神经元数目逐渐减少 ;与模型组比较 ,脑缺血预处理组和药物预处理组在再灌注各时相海马CA1区神经元丧失显著减少 ,统计学处理差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;药物预处理组与缺血预处理组在再灌注各时相存活神经元数目之间差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。以上结果说明 ,药物预处理能够抑制海马CA1区神经元缺失 ,对脑神经元损伤有保护作用 ,其作用程度与缺血预处理接近。 (见附表 )附表 不同再灌注时间各组脑组织中海马CA1区存活神经元数目 (个 /mm)组别n 2 4h 48h 72h 7d模型组 5175.2± 5.63 162 .2± 6.50 14 4 .4± 5.3 2 114 .6± 6.2 3 缺血预处理组 5194.8± 5.17△ 180 .4± 3 .0 5△ 177.2± 2 .77△ 156.0± 4.0 6△药物预处理组 52 0 2 .0± 6.60 △ #184.4± 4.50 △ #178.8± 3 .0 3 △ #158.8± 4.15△ # 注 :与假手术组比较 : P <0 .0 5 ;与模型组比较 :△ P <0 .0 5 ;药物预处理组与缺血预处理组比较 :# P >0 .0 52 .2 对海马CA1区神经元形态和结构的影响 假手术组海马CA1区的显微结构正常 ,海马CA1区显微结构正常 ,细胞膜完整 ,边缘清晰 ,细胞浆染色均匀 ,细胞核清晰 ,未见核固缩、核碎理解、核溶解 (图1)。模型组海马CA1区的细胞损害明显 :细胞膜可见缺损 ,边缘模糊 ,细胞体积增大 ,可见细胞水肿 ,少数细胞有核固缩、坏死 (图 2 )。脑缺血预处理组和药物预处理组海马CA1区细胞损伤明显减轻 ,只有少量细胞有轻度水肿 ,细胞核清晰 ,未见坏死 (图 3、4 )。以上结果表明 ,海马CA1区神经元在脑缺血再灌注损伤中发生变性死亡 ,而缺血预处理和药物预处理均可减少海马CA1区脑组织显微结构的损害 ,且二者作用程度一致。3 讨 论短暂缺血可以减轻随后发生的长时间缺血所造成的损害 ,这一现象称为缺血预处理 (ischemicpre conditioning,IPC )。IPC首先由Murry等<2 > 于1986年提出。虽然IPC对脑缺血的保护效应已属公认 ,但IPC诱导损伤性应激过程终究是一种创伤。因此 ,人们一直在探索更有临床实用价值的预处理方法。脑药物性预处理正是基于这一思路而提出来的 ,即通过药物激发和模拟机体自身内源性保护物质而呈现出脑保护作用。脑泰方是葛金文教授在益气活血法研究的基础上所创立的中医方剂 ,具有益气活血、祛风化痰之功效。一般认为 ,脑缺血时由于神经细胞缺氧和葡萄糖供应能量不足 ,并导致神经细胞的变性 ,甚至坏死<3～ 6 > 。在缺血时所见大鼠海马CA1区神经细胞胞体水肿、细胞器消失、核固缩或溶解等均属于结构性损伤 ,是细胞变性、坏死的形态学标志。本研究结果显示 ,脑缺血预处理组能够减轻血脑屏障破坏 ,减轻细胞毒性脑水肿 ,保护易损区海马CA1区神经元免遭延迟性细胞死亡。符合文献报道 ,证实了脑缺血预处理造模效果基本可靠。与模型组比较 ,海马CA1区脑组织超微结构损害明显减轻 ,而存活神经元数目却明显增加 ,研究结果与文献报道基本一致。表明了药物预处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用脑泰方提取物预处理对脑缺血再灌注沙土鼠海马神经元的影响@谭琥$湖南中医学院!湖南长沙410007
@葛金文$湖南中医学院!湖南长沙410007脑泰方提取物;;
脑;;缺血预处理;;神经元目 的:探讨脑泰方提取物预处理减轻沙土鼠脑缺血再灌注损伤的作用。方法:采用钳夹双侧颈总动脉建立沙土鼠脑缺血模型,将65只沙土鼠随机分为假手术组,脑缺血再灌注损伤组(IR组)、脑缺血预处理组(IPC组)、脑泰方提取物预处理组(NPC组) ,根据再灌注不同时间(2 4、4 8、72h和7天)。将IR组、IPC组、NPC组各分4个亚组(n =5 )。观察各时相沙鼠海马CA1区神经元状况,海马CA1区存活神经元数目。结果:(1)IPC组、NPC组与IR组同期比较,海马CA1区存活神经元数目明显增多(P <0 .0 5 ) ,脑组织结构明显改善;(2 )各组不同时相比较:随着再灌注时间延长,海马CA1区存活神经元数目逐渐减少,至第7天达最 低;(3)药物预处理组与缺血预处理组比较:海马CA1区存活神经元数目差异无显著性意义(P>0 .0 5 )。结论:脑泰方提取物预处理具有抑制沙土鼠脑缺血再灌注损伤的作用<1>ZivinJA ,ChoiDW .Stroketherapy
.ScientAmer,1991,265(1):31
<2>MurryCE ,JenningRB ,ReimerKA ,etal.Precondition ingwithischemia;adelayoflethalcellinjuryinis chemicmyocardium.Circulation,1986,74:1124
<3>张法永,陈衔城,伍惠民,等.短暂缺血预处理减轻缺血性脑损伤的研究.中华实验外科杂志,2002,19(1):11～12
<4>SalinskaE ,PlutaR ,LazarewiczJW .ParticipationofNM DA -receptorsinischemicchangesofcalciumhomeostasisinrabbitb
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