溶栓疗法是治疗血栓症的常规方法 ,但目前市场上的溶栓药在半衰期、溶栓效果、价格以及副作用上存在一定问题 ,因此对安全性高、疗效好、经济的溶栓药物的研究与开发仍是当前研究的热点。枯草杆菌溶栓酶具有直接溶解血栓、溶栓效果好、可口服、副作用小等独特溶栓效果 <1> ,成为当前溶血栓药物的一个重要研究方向 ,具有很大的开发应用价值。本研究从一株诱变枯草杆菌的发酵液中分离纯化得到了一种新型溶栓酶 FSC2 - 1 3,并对其进行初步的体内外活性研究 ,探索其溶纤的方式和机理 ,为新型溶栓药物的开发进行探索 ,现报告如下。1 材料与方法1 .1 材料FSC2 - 1 3(由本教研室制备 ) ;尿激酶、凝血酶、纤维蛋白原标准品 (中国药品生物制品检定所 ) ;琼脂糖 ( Sigma公司 ) ;纤维蛋白降解产物 ( FDP)参考血浆、纤溶酶原 ( Pg)抗血清、纤维蛋白原 ( Fg)、硫酸鱼精蛋白标准品 (卫生部上海生物制品研究所 ) ;其他试剂均为分析纯 ,购于成都化学试剂厂。仪器 :p HS— 3C型精密 p H计 (上海雷磁仪器厂 ) ;WS2型电热恒温水浴箱 (上海医用恒温设备厂 ) ;LD5 - 2 A型离心机 (北京医用离心机厂 )。实验动物 :SD大鼠 ,雌雄各半 2 2 0～ 2 5 0 g,由四川大学华西实验动物中心提供 ,健康一级标准1.2 方法1 .2 .1 FSC2 - 1 3的制备 首先对一株具有溶栓活性的枯草杆菌菌株进行亚硝基胍诱变 ,并且采用纤维蛋白平板法定向筛选得到一株高溶栓活性的枯草杆菌菌株 ,命名为 Bacillus subtilis C2 - 1 3,然后从其发酵液中 ,采用丙酮分级沉淀、Sephadex G- 2 5脱盐、DEAE- Sepharose FF层析、Sephadex G- 75层析分离纯化得到一种纤溶活性较高的蛋白酶 ,命名为溶栓酶 FSC2 - 1 3。初步的理化性质研究发现 FSC2 -1 3的相对分子质量为 62× 1 0 3 ,等电点为 8.5 ,比活为 1 480 UK/mg,含糖量 32 % ,该物质为一种温度稳定型碱性丝氨酸蛋白酶<2 > 。1 .2 .2 纤维蛋白平板法 采用 Astrup法 ,按文献 <3 >进行。1 .2 .3 加热纤维蛋白平板法考察水解纤维蛋白方式 参照文献 <4> ,将制备好的纤维蛋白平板在 85℃加热 30 min,冷却至室温后 ,加入待测样品 ,在 37℃保温 1 8h,然后测定样品、尿激酶的活性 ,并与这些样品在常规纤维蛋白平板上的活性作为对照。1 .2 .4 SDS- PAGE法考察水解纤维蛋白原方式 参照文献 <5> ,取适量的样品溶液加入 2 mg/ml的纤维蛋白原溶液中 ,使酶与底物含量比为 1∶ 5 0 ,分别于 0 min,1 0 min,30 min,1 h,4h,1 2 h吸取适量反应液 ,加入等体积 SDS- PAGE样品缓冲液 ,煮沸 3min,将上述样品进行 SDS- PAGE,观察结果。1 .2 .5 体内溶纤活性研究1 .2 .5 .1 大鼠静脉血栓形成模型的建立 将实验动物随机分成两组 ,每组 6只 ,按文献 <6>进行操作 ,对照组在结扎血管前 2 h,于小肠近十二指肠端注射 0 .5 ml生理盐水 ,1 h后再给同样剂量 ;实验组则分两次共注射 1 ml样品溶液 ( 1 .5 mg/ml)。给药完1 h,在左肾静脉的下方 ,用粗棉线结扎下腔静脉 ,2h后 ,先从股动脉处采血 ,以 38g/L枸橼酸 ( 1∶ 9)作为抗凝剂采集血浆 ,并对血浆的成分进行进一步的分析。然后 ,在髋内静脉汇合处用粗棉线结扎下腔静脉 ,紧靠两个结扎线的外侧剪下这段血管 ,迅速将它置于木板上 ,以大头针固定后剪开 ,让未凝的血液自然流出。若有血栓形成 ,用游标卡尺 (精密度为0 .0 5 mm)测量血栓的长度 ,用吸水纸吸干血水后 ,于 37℃孵箱烘干 2 4 h,测量烘干后血栓的长度与质量。血栓形成抑制率定义为血栓重量的相对百分比 ,即对照组和样品组的差与对照组的百分比。1 .2 .5 .2 活化的部分凝血活酶时间 ( APTT)、Fg测定和硫酸鱼精蛋白凝集实验 ( 3P实验 ) 按文献 <7>进行操作。有效率定义为对照组和样品组的差与对照组的百分比。1 .2 .5 .3 Pg的含量测定 血浆样品同上 ,采用双向免疫扩散法<8> ,以倍比稀释的标准血浆作为对照测定血浆中的纤溶酶原的含量。1 .3 统计学方法数据以 x±s表示 ,两组均数的比较用 t检验 ,P<0 .0 5为有统计学意义。2 结果2 .1 FSC2 - 1 3水解纤维蛋白的作用方式实验发现样品在两种纤维蛋白平板上的溶斑面积基本保持不变 ,而尿激酶标准在 85℃孵育后的平板上基本没有表现纤溶活性。由于 85℃孵育后混杂的纤溶酶原已经被破坏 ,因此尿激酶作为纤溶酶原激活剂并不表现活性 ,而样品酶却仍出现溶斑 ,说明样品并不是通过激活纤溶酶原发挥作用 ,而是其自身便具有降解纤维蛋白的活性。2 .2 FSC2 - 1 3水解纤维蛋白原的作用方式取不同时间点的反应液 ,经 SDS- PAGE,结果见图 1 ,在 1 0 min时 ,纤维蛋白原的α、β均已被完全降解 ,γ链也被降解了 ,同时产生了一些相对分子质量较小的片段 ,其中包括一种相对分子质量为 1 5×1 0 3的片段。在 30 min时 ,γ链被完全降解并且相对分子质量 30× 1 0 3左右的片段含量升高 ,而在 1 h时 ,相对分子质量大于 2 0× 1 0 3的片段均已经被降解 ,相对分子质量为 1 5× 1 0 3片段的含量也有所降低 ,在 1 2 h时 ,从电泳图谱中只剩下一条不清晰的15× 1 0 3 的蛋白带。因此 ,可以看出 ,样品将纤维蛋白原降解成很小的片段 ,其在纤维蛋白原中有较多的水解位点。2 .3 FSC2 - 1 3体内溶纤活性研究2 .3.1 血栓形成 注射生理盐水后产生血栓长度为 ( 3.5± 0 .5 4 ) mm,干重为 ( 2 .5± 0 .34) mg,测得注射 FSC2 - 1 3后形成血栓的长度 ( 1 .3± 0 .43)mm,干重 ( 0 .8± 0 .2 ) mg,计算得血栓形成抑制率为 68%。两组间数据存在显著性差异 ( P<0 .0 1 ) ,同时由图 2可见两组血栓外观大小有着明显差异 ,表明 FSC2 - 1 3对血栓形成有较好的抑制作用。2 .3.2 大鼠血浆的各项指标分析 结果表明 ,FSC2 - 1 3能够明显抑制血栓的形成 ,部分凝血活酶时间 ( APTT)明显延长 ,这都反映给药组大鼠处于一种比较高的纤溶水平。由附表可知 ,实验组纤维蛋白原的含量显著降低 ,纤溶酶原的含量未见明显差异 ,3P实验结果提示 FDP升高。计算得给药组的血浆 APTT延长了 5 1 % ,纤维蛋白原含量降低了49%。图 2 血栓外观对比Fig 2 Appearence of throm bus in contrast with control experiment附表 两组血浆 APTT、Fg、Pg含量的比较 ( x± s)Table Comparison of APTT,Fg,Pg contents between the twogroups( x±s)Group n APTT( s) Fg( mg) Pg( mg) 3 PControl 62 9.4± 1.983 .9± 0 .2 2 16.41± 0 .2 9-FSC2 -13 64 4.4± 4.11* 2 .0± 0 .3 1* 16.4± 0 .2 8+ * P<0 .0 1,vs control grouop3 讨论枯草杆菌溶栓酶由于其独特的溶栓效果而具有很好的开发应用价值 ,但其在溶栓活性、作用方式及稳定性等方面存在一定的缺陷 ,同时还由于其发酵含量不高 ,而制约了其大规模工业化生产。为了提高效价 ,降低成本 ,同时寻找新的酶源 ,我们采用紫外线和亚硝基胍对一株具有溶栓活性的枯草杆菌菌株进行诱变处理 ,得到了具有高溶栓活性的突变菌株。血栓与止血的基础研究表明 ,降解纤维蛋白主要可通过激活纤溶酶原途径和直接水解纤维蛋白途径。我们在进行水解纤维蛋白作用方式的研究中 ,加热平板是为了灭活市售纤维蛋白原试剂中混杂的少量的纤溶酶原 ,这样纤溶酶原激活剂在这种平板上便不表现活性 ,而直接水解纤维蛋白的纤溶酶仍可表现活性 ,因此仍可出现溶斑 ,通过此方法可以判断样品水解纤维蛋白的作用方式。实验结果表明FSC2 - 1 3是通过水解纤维蛋白达到溶栓目的 ,这种溶纤方式作用直接 ,并且副作用小 ,不激活体内的纤溶途径 ,直接作用血栓 ,提示 FSC2 - 1 3可能会比目前常用的溶栓药较少引起出血性倾向 ,从而提高其溶栓的安全性。FSC2 - 1 3能够将 Fg水解成很小的片段 ,其中在 30 min时 ,已经检测不到 Fg三个亚基 ( α、β、γ) ,这说明样品在 3个亚基上都有酶解位点 ,提示其具有很强的纤溶活性。而纤溶酶和现在已知的多数具有水解纤维蛋白活性溶栓酶对 Fg的裂解始于 Aα链的 C端部分和 Bβ链 1 - 42 ,形成片段 X ( 2 4 7×1 0 3 )。纤溶酶然后再裂解片段 X的螺旋区 ,产生片段Y( 1 5 0× 1 0 3 )和片段 D( 95× 1 0 3 )。片段 Y可被进一步降解成片段 E( 5 0× 1 0 3 ) <9> 。因而 FSC2 - 1 3这种水解行为与现在已知的溶栓酶不同。临床的
More abstracts about the 1株诱变的枯草杆菌溶栓酶体内外溶栓性质初探